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本试剂盒采用一步法荧光qRT-PCR，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中的甲型肝炎病毒进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。

本试剂盒适用于检测的疑似感染者的血液等标本中甲型肝炎病毒RNA，适用于甲型肝炎病毒感染的辅助诊断，仅供科研使用。

• 本试剂盒仅供体外检测使用，操作人员必须经过培训，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。
  
• 不要使用过期组分，不同批次试剂盒的组分液不可混合使用。
  
• 本试剂盒中的试剂尽量避免反复冻融，冻融不要超过5次，可分装后使用。
  
• 样本采集和处理过程应遵循生物安全管理要求。
  
• 荧光PCR实验严格分区操作，各区应有专用的手套、移液器等。不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循单方向工作原则，各工作区相对隔离。
  
• 测试样本时，应做好生物安全防护。
  
• 实验完毕后，需丢弃的试剂、样本应进行无害化处理。

• 样本的采集：采集过程按照相关标准要求进行。
  
• 核酸提取：可选购我公司的柱式RNA提取试剂盒(货号：SYA781)，或其他合适的RNA提取试剂，并按相应产品的使用说明操作。
  
  • 阳性对照和阴性对照无需进行核酸提取，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样本制备区域加入阳性对照。
• 试剂的准备：从试剂盒中取出甲型肝炎病毒反应液、酶混合液，室温融化并震荡混匀后，10000rpm离心10s。

• 配制反应体系：
  

  成分	用量
  甲型肝炎病毒反应液	14μL
  酶混合液	1μL
  样本核酸/标准品/阴性对照	5μL

  • 建议由低浓度向高浓度的顺序加入阳性对照模板，避免高浓度阳性对照造成的污染。
• 反应程序：
  

  过程	温度	时间	循环数
  产物消化	45℃	10min	1
  预变性	95℃	10min	1
  PCR扩增	95℃	15sec	40
  	60℃	45sec

  • 在60℃延伸时收集荧光信号，报告基团设置为FAM。
    
  • 使用ABI品牌仪器时，需将淬灭基团改为NONE，请勿选择ROX参比荧光。

• 试验成立判定
  
  • 阴性对照：不应产生任何的扩增曲线。
    
  • 阳性对照：均产生扩增曲线。
    
  • 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
• 结果判定
  
  • 定性分析：
    

    	Ct值≤35	无Ct值	35≤Ct值≤40，且有明显扩增曲线
    FAM	阳性+	阴性-	可疑样本

    对于可疑样本，重新提取核酸，再次进行对应的PCR检测。如果重复结果Ct值≤40，且出现对数扩增曲线判为样本阳性；否则判为样本阴性。
    
  • 定量分析：使用Excel等线性分析工具，根据阳性对照梯度浓度值与仪器所测Ct值，创建线形图及分析公式，相关系数R2应介于0.97～1之间。通过将样本的Ct值代入公式可计算样本DNA含量的拷贝数。