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人类的流感主要由甲型流感病毒(Influenza A Virus)和乙型流感病毒(Influenza B Virus)引起，其中甲型流感病毒曾多次引起世界性大流行，乙型流感病毒常常只引起局限性流行。因此有必要及时对流感病毒进行检测和分型，以采取不同的防范措施。

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是分别根据甲型流感病毒和乙型流感病毒的高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
   
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
   
6. 既可用检测，又可用于分型。甲型流感病毒的探针使用FAM标记，乙型流感病毒的探针使用HEX标记。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入40μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在6号管中加入两种浓度为1×10⁷拷贝/μL的阳性对照各5μL，充分震荡1分钟，得浓度各为1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL上步稀释所得的样品，充分震荡1分钟，得浓度各为1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入上步稀释所得的样品，充分震荡1分钟，得浓度各为1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号管中的样品再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于RT-PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的样品做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	标准曲线样品管 (1～6管)
    探针法qRT-PCR缓冲液	各10μL	10μL	各10μL
    探针法qRT-PCR酶混合液	各2μL	2μL	各2μL
    甲型-乙型流感病毒qRT-PCR引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
    N+2个待测RNA样本	各5μL	不加	不加
    超纯水	不加	5μL	不加
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	不加	不加	各5μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
    

    过程	温度	时间
    逆转录	50℃	15min
    预变性	95℃	3min
    PCR反应 (45个循环)	95℃	15sec
    	60℃	60sec(采集FAM和HEX通道的荧光信号， FAM的淬灭基团为TAMRA， HEX的淬灭基团为MGB)

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。FAM信号得到的Ct值制备的标准曲线用于计算甲型流感病毒的浓度，HEX信号得到的Ct值制备的标准曲线用于计算乙型流感病毒的浓度。
    
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须没有读数，或者大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其Ct没有读数、大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。FAM信号得到的Ct推断出的结果针对的是甲型流感病毒，通过HEX信号得到的Ct推断出的结果针对的是乙型流感病毒。