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本公司开发牛腺病毒(4-8型)通用染料法荧光定量PCR试剂盒。


牛腺病毒(Bovine Adenovirus，BAV)会引起牛的呼吸道疾病和肠道疾病，主要特征为肺炎、肠炎、结膜炎和多发性关节炎，是牛犊死亡的重要原因之一，其易感染性和潜伏性给畜牧业以及国际贸易带来严重的经济损失。

1. 即开即用，用户只需要提供DNA模板。
   
2. 引物根据牛腺病毒(4-8型)序列高度保守区设计，特异性高。
   
3. 荧光定量PCR检测，比常规PCR更加灵敏。
   
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
   
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
   
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

组分	规格
2×qPCR Magic Mix	500μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
牛腺病毒(4-8型)通用染料法qPCR引物混合液	100μL
牛腺病毒(4-8型)通用染料法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年。


一、稀释PCR阳性对照(以10²～10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL PCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品DNA。
   
8. 用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液，浓度为10E4拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	PCR阳性对照管 (2～7管)
    2×qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
    牛腺病毒(4-8型)通用染料法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
    自备10×ROX(见注)	2μL	2μL	各2μL
    N+2待测样品cDNA模板	6μL	-	-
    自备超纯水	-	6	-
    第7步所得PCR阳性对照稀释液(2～7号)	-	-	各6μL

    注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。
    
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5min
    PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min，(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品cDNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于35则为阴性，如果小于或等于30则为阳性。如果在30～35之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于35，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

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