产品货号：
BTN14-23300
中文名称：
牛冠状病毒(BCoV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)
英文名称：
Bovine Coronavirus SYBR qRT-PCR Kit
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
背景资料：
产品特点：
产品组成：
保存：-20℃，阳性对照需要单独放置，有效期一年。
溶液配制：
牛冠状病毒qRT-PCR引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
使用方法：
一、稀释阳性对照
以101～106这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。
二、样品RNA的制备
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
四、数据处理
相关搜索：牛冠状病毒(BCoV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)，Bovine Coronavirus SYBR qRT-PCR Kit
本制品是百奥莱博公司基于染料法荧光定量RT-PCR技术开发的，专门用于牛冠状病毒(BCoV)研究检测的试剂盒。
背景资料：
牛冠状病毒是β属有囊膜RNA病毒，在全球牛群中普遍流行。主要通过消化道、呼吸道传播，可造成新生犊牛腹泻、成年牛冬季血痢及呼吸道病症，幼畜病死率较高，严重损害养殖收益。该病毒与人OC43冠状病毒亲缘相近，极少感染人类。临床多依靠RT-PCR检测，暂无特效治疗药物，疫苗与精细化饲养是主要防控手段。
产品特点：
- 一站式，用户不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
- 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到100拷贝/反应。
- 根据牛冠状病毒的保守序列设计引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
- 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
- 本制品可用于定性检测，也可用于定量检测。定量检测时线性范围至少有5个数量级。
- 本制品足够50次20μL体系的qRT-PCR反应。
- 本制品只能用于科研。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| 2×SYBR qRT-PCR缓冲液 | 500μL |
| SYBR qRT-PCR酶混合液v2 | 50μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 牛冠状病毒qRT-PCR引物干粉 | 50T |
| 牛冠状病毒qRT-PCR阳性对照(107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，阳性对照需要单独放置，有效期一年。
溶液配制：
牛冠状病毒qRT-PCR引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
使用方法：
一、稀释阳性对照
以101～106这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。
- 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头(下同)。
- 换枪头，在6号管中加入5μL 107拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL 106拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
- 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为104拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照，加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样。可以用水作为核酸制备的阴性对照NC。
- 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
成分 样品管
N+2个RT-PCR阴
性对照RT-PCR
阳性对照(1～6管)2×SYBR qRT-PCR
缓冲液10μL 10μL 各10μL 牛冠状病毒qRT-PCR引物混合物 2μL 2μL 各2μL N+2个RNA模板 7μL － － 自备超纯水 － 7μL － 6个阳性对照稀释液 － － 各7μL SYBR qRT-PCR酶混合液v2 1μL 1μL 1μL - 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 温度 时间 RT(逆转录) 50℃ 30min 预变性 95℃ 2min RT-PCR反应
(45个循环)95℃ 15sec 60℃ 15sec(采集SYBR通道的荧光信号) 72℃ 15sec 按仪器预设程序进行溶解曲线分析
四、数据处理
- 通过溶解曲线分析排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品结果，归为假阳性，此样本Ct数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
- 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和PCR阴性对照)的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。如果两种阳性对照(样品制备阳性对照和PCR阳性对照)无Ct值则无效。
- 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性，有Ct但Tm与阳性样本不同，实验有效可以继续分析其它样品有效数据。
- 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
- 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。
相关搜索：牛冠状病毒(BCoV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)，Bovine Coronavirus SYBR qRT-PCR Kit