流行性出血热病毒(EHDV)荧光定量PCR试剂盒(染料法)

产品货号：

BTN14-19200

中文名称：

流行性出血热病毒(EHDV)荧光定量PCR试剂盒(染料法)

英文名称：

Epizootic Hemorrhagic Disease Virus qPCR Kit(SYBR)

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

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本试剂盒根据流行性出血热病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。

出血热即流行性出血热又称肾综合征出血热，是危害人类健康的重要传染病，是由流行性出血热病毒（Epizootic Hemorrhagic Disease Virus，EHDV）引起的，主要传播为动物源性，病毒能通过宿主动物的血及唾液、尿、便排出，鼠向人的直接传播是人类感染的重要途径。以发热、出血、充血、低血压休克及肾脏损害为主要临床表现。因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。

试剂盒特点：

一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
本产品足够50次20μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

试剂盒组成：

组分	规格
2×qRT-PCR缓冲液	500μL（棕色管）
10×qRT-PCR酶混合液	100μL（红盖）
ROX染料I，50×	20μL（棕色管）
ROX染料II，50×	20μL（棕色管）
荧光PCR专用模板稀释液	1mL（亮黄盖）
流行性出血热病毒qRT-PCR引物混合液	100μL（白盖）
流行性出血热病毒qRT-PCR阳性对照（1×10⁸拷贝/μL）	50μL（黄盖）
沙核酸释放剂（试用装）	20次（1mL，绿盖）

保存：-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要单独放置。

使用方法：

一、稀释阳性对照（以10²-10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。

标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂（货号：BTN61202）试用装。

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：

成分	N+2个制备所得样品	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性对照（2-7管）
2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
流行性出血热病毒qRT-PCR 引物混合液	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
N+2个RNA模板	5.6μL	不加	不加
6个阳性对照稀释液	不加	不加	各5.6μL（2号样到2号管， 3号样到3号管…）
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注：
需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

过程	温度	时间
RT（逆转录）	50℃	15-30分钟
预变性	94℃	2分钟
RT - PCR反应（40个循环）	95℃	15秒
	60℃	15秒（采集FAM通道的荧光信号）
	72℃	15秒
按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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