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本产品是定性PCR产品(产品编号11-150)基础上升级的定量PCR检测试剂盒。


专门用于定量鉴定检测CPV。犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)在分类上属细小病毒属细小病毒科，是一种单链DNA病毒。CPV是感染犬、猫、狼、狐等动物并引起细小病毒病，感染率高达100%，致死率10～50%。PCR是目前检测CPV最灵敏的方法。

1. 根据CPV衣壳蛋白基因VP2设计的针对CPV的PCR引物，专一性强。
   
2. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。
   
3. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
   
4. 本试剂盒足够100次20μL反应体系的荧光定量PCR。
   
5. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

组分	规格
2×qPCR MagicMix	1.0mL(装A袋)
超纯水	1mL×2(装A袋)
引物14-15000F	1 OD(装B袋)
引物14-15000R	1 OD(装B袋)
犬细小病毒VP2基因阳性对照(10E8copy/μL)	50μL(装C袋)

保存：-20℃，有效期一年。


一、样品DNA的制备

1. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的柱式病毒DNA提取试剂盒。

二、引物的制备(在样品制备室进行)

2. 按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水(加入量见引物试管上的标签)，使得两条引物的浓度均为10μM(10pmol/μL)，然后各取110μL混合在一起，标注为引物混合物，放冰上待用。此引物混合物足够100次PCR。

三、稀释阳性对照(以10²～10⁷这6个10倍稀释度为例。由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为180bp的DNA片段作为阳性对照。

3. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
   
4. 用带芯枪头分别加入45μL超纯水(最好用带芯枪头，下同)。
   
5. 在7号管中加入5μL本试剂盒提供的10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
6. 换枪头，在6号管中加入5μL 10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
7. 换枪头，从6号管中取5μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
8. 换枪头，从5号管中取5μL溶液到4号管中，得10E4拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

三、设置PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9. 在PCR管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
   

   成分样品阴性对照阳性对照(2～7管)
   2×qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
   引物混合物	2μL	2μL	各2μL
   自备10×ROX(见注)	2μL	2μL	各2μL
   待测样品DNA模板	1～5μL	不加	不加
   阳性对照(2～7号)	不加	不加	各5μL
   补水到	20μL	20μL	20μL

   注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX。
   
10. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(可以根据仪器不同而自行优化)。
    

    过程	温度	时间
    预变性	94℃	2分钟
    PCR反应 (40个循环)	94℃	15秒
    	60℃	30秒

    
    
    
11. 数据采集在每个循环的第二步进行荧光信号的采集，具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。

四、数据处理

12. 以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品浓度的log和标准曲线计算出样品DNA的浓度。

相关搜索：犬细小病毒(CPV)荧光定量PCR试剂盒(染料法)，Canine Parvo Virus qPCR Kit(SYBR)