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本制品是基于常规RT-PCR技术开发的专门检测传染性胰脏坏死病病毒的试剂盒。


传染性胰脏坏死病病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus)为双RNA病毒属(Birnavirus)，是目前已知鱼类病毒中最小的RNA病毒。感染该病毒后常见症状为鱼类游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重复以上游动，直至死亡。主要的特征是胰腺坏死，胰腺泡、胰岛及所有的细胞几乎都发生异常，多数细胞坏死，特别是核固缩、核碎裂十分显著，有些细胞的胞浆内有包涵体。疾病后期，肾脏的造血组织和肾小管也发生变性、坏死，肝脏局灶性坏死，消化道的粘膜发生变性、坏死、剥离。因此快速灵敏诊断传染性胰脏坏死病病毒具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
   
2. 产品经过精心优化，分析灵敏性为1000拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据传染性胰脏坏死病病毒RNA高度保守区设计，只能检测传染性胰脏坏死病病毒，不会跟除此之外的其他生物的RNA发生交叉反应。
   
5. 本制品足够50次20μL体系的RT-PCR反应。
   
6. 本制品只能用于定性实验，不能用于定量实验。
   
7. 本制品只能用于科研。

组分	规格
2×RT-PCR Buffer	500μL
10×RT-PCR酶混合液	50μL
超纯水	1mL
传染性胰脏坏死病病毒RT-PCR引物混合干粉	50T
传染性胰脏坏死病病毒RT-PCR阳性对照(1×104拷贝/μL)	250μL

保存：-20℃，有效期2年。

1. 引物干粉在使用前需短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
   
2. 为避免扩散传染性病原，本制品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA片段作为阳性对照。如果需要RNA片段作为阳性对照的需要单独定制。

一、样品RNA的制备

1. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL试剂盒提供的RT-PCR阳性对照(1×10⁴拷贝/μL)再加上一定量的水作为核酸纯化的阳性对照(加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所需要的起始样品体积相同)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
2. 用自选方法纯化上述N+2个样品的RNA。本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选用本公司的相关的核酸提取试剂盒或免核酸提取释放剂。

二、设置RT-PCR反应(20μL体系)

3. 标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的RNA样品，额外增加的两个管一个用于RT-PCR阳性对照，另一个用于RT-PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR 阳性对照
   2×RT-PCR Buffer	各10μL	10μL	10μL
   10×RT-PCR酶混合液	1μL	1μL	1μL
   传染性胰脏坏死病病毒RT-PCR引物混合液	各2μL	2μL	2μL
   制备的N+2个RNA样品	各7μL	不加	不加
   超纯水	不加	7μL	不加
   传染性胰脏坏死病病毒RT-PCR阳性对照 (1×104拷贝/μL)	不加	不加	7μL

   
   
4. 上机进行RT-PCR，RT-PCR反应参数为：
   

   过程	温度	时间
   逆转录	42℃	55分钟
   预变性	95℃	5分钟
   PCR反应 (30个循环)	95℃	15秒
   	55℃	60秒
   	65℃	60秒
   延伸	72℃	10分钟

三、电泳分析

5. 取10μL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%～2.0%的琼脂糖凝胶。
   
6. 阳性样品预期得到的扩增产物长度为110bp。如果两个阴性对照(样品制备阴性对照或RT-PCR阴性对照)有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。
   
7. 如果所有样品和RT-PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题(试剂，设备，程序，操作等)，需要重复并排查原因。
   
8. 如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中扩增产物的判断为阳性，无则判定为阴性。

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