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本制品可用于在天然或变性条件下从糖蛋白或糖多肽中切割N-糖苷键，从而去除N-聚糖链。PNGase F是一种通过E.coli重组表达来源于Elizabethkingia miricola的糖基肽酶。PNGase F可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖、混合型和复杂寡聚糖的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和天冬酰胺(Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖，将蛋白和糖链修饰分开(图1)，可用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去除N-糖基化修饰反应。另外Concanavalin A磁珠分离细胞或膜蛋白后，可使用PNGase F酶进行糖基的切除，从而使糖蛋白从Concanavalin A磁珠上解离下来，对于后续膜蛋白的质谱分析有很大帮助。本糖基肽酶F的N端带有His-tag，可以通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。

• 抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去N-糖基化修饰；
  
• 表征蛋白是否存在N-糖基化修饰。

糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能。最新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。

CAS号	83534-39-8
分子量	36kDa
纯度	≥95% by SDS-PAGE,protease-free.

一个单位的定义是，在37℃条件下，10μL反应体积中，1小时内从10μg变性RNase B中去除>95%的碳水化合物所需的酶量。

组分	25T	100T	500T
PNGase F(500U/μL)	25μL	100μL	500μL
10×Reaction Buffer	100μL	400μL	2mL
10×Denaturing Buffer	50μL	200μL	1mL
10×Renaturing Buffer	100μL	400μL	2mL

保存：-20℃，有效期1年。


本制品用于去除糖蛋白或糖肽的N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的酶切反应时，如果按照每100μg糖蛋白使用1μL (500U/μl)在37℃反应1小时，本制品三种包装规格分别可以用于2.5mg、5mg和25mg糖蛋白的N-糖苷移除，相当于25、100和500次反应。


10mM Tris (pH7.4)，50mM NaCl，5mM EDTA。储存液不含甘油，便于HPLC方法优化色谱条件。


10×Reaction Buffer：500mM Sodium Phosphate (pH7.5)。

• PNGase F不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
  
• 超纯水推荐选购无菌无酶超纯水(货号：YT998)。

• PNGase F移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图
  
  图1．糖链可以在图中戊糖(pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
  
• PNGase F最佳酶切温度为37℃，在较宽的pH范围(6.0-10.0)，在较宽的温度范围(4～50℃)，较宽的离子强度范围(0-1M NaCl)内均具有较高的酶活性。本制品与国外同类产品Competitor N相比，去除蛋白糖基的效果基本一致(图2)。
  
  图2．PNGase F去除蛋白糖基化修饰的效果图。在20μL反应体系中，加入10μg N-糖基化修饰蛋白及相应量的本制品或国外同类产品Competitor N，37℃孵育1小时后，加入4μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(货号：YTC0010)，混匀后95℃加热5分钟，使用PAGE预制胶(Tris-Gly体系，货号：YTC0020)电泳，蛋白Marker为彩色预染蛋白Marker(6.5～270kD，货号：YT631)，并经BalbBlue考马斯亮蓝超快染色液(货号：YTB1029)染色。图中可见经PNGase F处理后，糖基化蛋白的迁移率发生变化，蛋白条带大小从略大于66kDa转变为约52kDa。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
  
• 体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
  
  图3．PNGase F去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μL反应体系中，加入10μg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后95℃加热5分钟，经PAGE预制胶(Tris-Gly体系，货号：YTC0020)电泳，Marker为彩色预染蛋白Marker(6.5～270kD)，并经BalbBlue考马斯亮蓝超快染色液染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

• 变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
  
  • 按下表在1.5mL离心管中配制反应体系，并充分混匀。
    

    成分	用量
    Protein (10～100μg)	X
    10×Denaturing Buffer	1μL
    超纯水	至10μL

    • 因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
  • 100℃加热10分钟，使蛋白充分变性。
    
  • 置于冰浴，冷却至少10秒，10000g离心3～5秒，确保所有溶液聚集于管底。
    
  • 向上述10μL变性体系中，加入2μL 10×Reaction Buffer，2μL 10×Renaturing Buffer和6μL H2O，充分混匀。
    
  • 加入1μL PNGase F (500U/μL)，充分混匀，37℃孵育1～4小时。
    
    • 如果蛋白量比较少，也可以用1×Reaction Buffer对PNGase F进行适当稀释后使用。
      
    • 因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
  • 加入4μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后95℃加热5分钟，使用PAGE预制胶(Tris-Gly体系，货号：YTC0020)进行电泳检测和考马斯亮蓝染色。
    
  • 观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
• 非变性去N-糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)：
  进行非变性去N-糖基化修饰反应时，建议平行做一组变性去N-糖基化修饰反应，以便提供完全去除N-糖基化修饰蛋白的阳性对照。可以通过比较非变性反应与变性反应，以确定非变性反应的去N-糖基化程度。
  
  • 按下表在1.5mL离心管中配制反应体系，并充分混匀。
    

    成分	用量
    Protein (10～100μg)	X
    10×Reaction Buffer	2μL
    PNGase F (500U/μL)	1μL
    超纯水	至20μL

    • 因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
  • 37℃孵育4～24小时。
    
    • 因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
  • 加入4μL 6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后95℃加热5分钟，使用PAGE预制胶(Tris-Gly体系，货号：YTC0020)进行电泳检测和考马斯亮蓝染色。
    
  • 观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。

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