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本制品是表达纯化获得的重组酶。大肠杆菌DNA连接酶(E.coli DNA Ligase)是一种以NAD⁺ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)为辅酶，Mg²⁺依赖的，催化双链DNA中5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键，即催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的DNA连接酶[1]。

E.coli DNA Ligase可催化双链DNA相邻粘性末端5'磷酸和3'羟基磷酸二酯键的形成，但常规条件下不能进行平末端双链DNA的连接。在添加10～15% PEG和适当高浓度的单价阳离子时，也可以催化平末端双链DNA的连接反应。E.coli DNA Ligase在一定温度范围内(4～37℃)均具有活性，同时可以被热失活(65℃孵育20分钟)。

• 粘性末端双链DNA分子的连接；
  
• 双链DNA的缺刻修复；
  
• cDNA第二链合成后的克隆。

纯化自携带编码E.coli DNA ligase的E.coli重组菌株。


一个活性单位是指在20μL反应体系中，16℃反应温度，30分钟内连接50%的λDNA HindIII切割片段所需的酶量。

组分	200U	1000U	5000U
E.coli DNA Ligase(10U/μL)	20μL	100μL	500μL
10×Reaction Buffer	100μL	500μL	2mL

保存：-20℃，有效期2年。


10mM Tris-HCl，50mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，200μg/mL BSA，50% Glycerol (pH7.4@25℃)。


10×Reaction Buffer:
300mM Tris-HCl，40mM MgCl₂，260μM NAD，10mM DTT，500μg/mL BSA (pH8.0@25℃)。


不含除E.coli DNA Ligase之外的其它种类的DNA连接酶，不含内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。


65℃孵育20分钟可使E.coli DNA Ligase失活。


大肠杆菌DNA连接酶需要以NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅酶，而不是像T4 DNA连接酶等以ATP为辅酶。
大肠杆菌DNA连接酶对于平末端片段的连接效率是极低的，对于平末端的连接建议使用T4 DNA Ligase。
大肠杆菌DNA连接酶的催化底物是双链DNA分子，不能用于单链DNA或RNA的连接反应。
大肠杆菌DNA连接酶连接反应需要以NAD作为辅助因子，10×Reaction Buffer中含有辅助因子NAD，因此10×Reaction Buffer建议长期保存于-80℃，以延长NAD半衰期。



图1.E.coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果图。利用BalbFusion DNA聚合酶，使用两端带有Hind III酶切位点的引物对靶基因进行PCR扩增，生成两种不同长度的两端带有Hind III酶切位点的平末端双链线性DNA分子(900bp和600bp)，随后使用HindIII限制性内切酶对PCR产物进行酶切，获得两端带有互补粘性末端的双链线性DNA分子，分别作为Substrate 1 (900bp)和Substrate 2 (600bp)；在20μL反应体系(30mM Tris-HCl,4mM MgCl₂,1mM DTT,26μM NAD,50μg/mL BSA,PH8.0@25℃)中，分别加入400ng经PCR扩增及Hind III酶切产生的两种双链DNA片段，以及图中指定量的本制品或N公司的E.coli DNA Ligase，16℃孵育30分钟进行连接，然后65℃孵育20分钟以终止反应。取出10μL反应产物，加入2μL 6×DNA上样缓冲液，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本品与N公司的竞品相比，具有相当的连接粘性末端双链线性DNA的效果。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

• 参考下表在冰浴中配制反应体系(以20μL体系为例)：
  

  成分	用量	终浓度
  dsDNA	xμl	≤0.25μg/μL
  10×Reaction Buffer	2μL	1×
  E.coli DNA Ligase(10U/μL)	1μL	0.5U/μL
  无核酸酶水	(17-x)μL	-
  总体积	20μL	-

  • 如果同时进行多个反应，可把上表中除底物DNA之外的所有组分预先混合，然后再分装到各反应管。
    
  • E.coli DNA Ligase使用时宜存放在冰盒内或冰浴上。
• 轻轻震荡混匀或移液器反复吹打混匀，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
  
• 反应条件：16℃孵育30～60分钟。
  
• 终止反应：反应结束后立即将反应产物在65℃条件下孵育20分钟，以终止反应。
  
• 将反应后的产物进行琼脂糖凝胶或聚丙烯凝胶电泳，拍照观察并分析连接效果。如果需要从琼脂糖凝胶中回收DNA样品，推荐使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；如果需要从酶切消化反应体系中纯化DNA样品，推荐使用PCR产物DNA纯化试剂盒。
  
• 其他用途请自行参考E.coli DNA Ligase的相关文献资料进行。

• E.coli DNA Ligase和T4 DNA Ligase有什么区别？
  在推荐的使用条件下，E.coli DNA Ligase不能连接平末端DNA或RNA分子。
  
• E.coli DNA Ligase能否被热失活?
  可以。将E.coli DNA Ligase在65℃条件下孵育20分钟，即可使其完全失活。
  
• 应该选用哪种连接酶或连接试剂盒?
  如果需要平末端或粘性末端的快速连接，建议使用快速DNA连接试剂盒。T4 DNA连接酶是大多数DNA重组反应所选用的酶，可用于粘性末端(室温10分钟连接)或平末端(室温2小时或过夜)的连接。E.coli DNA Ligase对底物的选择比T4 DNA Ligase更具有特异性，如果只需要粘性末端的连接，抑制平末端或RNA分子的连接，建议使用E.coli DNA Ligase。如果实验目的是单链DNA或RNA分子的连接，建议使用T4 RNA连接酶。

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