牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(DNA Topoisomerase I)是一种来源于牛痘病毒(vaccinia virus)的I型真核拓扑异构酶，可以催化双链DNA分子中单链DNA特定序列位置的磷酸二酯键的断开和连接。Vaccinia DNA Topoisomerase I具有解超螺旋的酶(DNA Relaxing Enzyme)活性，可以通过快速的酶切和连接从而使双链共价闭合环状的正或负超螺旋DNA发生解超螺旋，从而可以形成含有较少的正或负超螺旋的双链环状的DNA分子。Vaccinia DNA Topoisomerase I也能使双链DNA形成绳结(knotting)或解开绳结(unknotting)，联结互补的单链环状DNA成为双链环状DNA。Vaccinia DNA Topoisomerase I目前常被作为一种DNA重组连接的新型工具酶，用于DNA载体和重组片段的连接、缺刻修复、接头连接等。
Vaccinia DNA Topoisomerase I能够特异性识别双链DNA中5'-… (C/T)CCTT…-3'序列，并酶切该序列中最后一个T和其之后的核酸序列之间的磷酸二酯键(5'-…(C/T)CCTT…-3')。在此过程中，断裂的磷酸二酯键的能量可以通过Vaccinia DNA Topoisomerase I活性位点的酪氨酸残基(Tyr274)与被切割的最后一个T的3'磷酸基团之间形成共价复合物而得以保留。该复合物又可以被Vaccinia DNA Topoisomerase I所酶切开的单链DNA的5'羟基所攻击，在不需要ATP和DNA连接酶的情况下，可以恢复形成之前的磷酸二酯键，即重新发生连接，同时释放出Vaccinia DNA Topoisomerase I。该酶切连接反应过程在超螺旋双链环状DNA的多个位点同时不断重复，从而可以使超螺旋环双链状DNA的超螺旋被解开。
Vaccinia DNA Topoisomerase I特异性识别的双链DNA中的5'-… (C/T)CCTT…-3'序列如果位于距离3'端几个碱基处，当Vaccinia DNA Topoisomerase I酶切DNA单链后，余下的带有5'羟基的单链DNA由于非常短而容易解离，此时Vaccinia DNA Topoisomerase I与5'-… (C/T)CCTT…-3'序列中最后一个T的3'磷酸基团之间形成的共价复合物，也可以被其它的5'端为羟基的DNA或RNA所攻击，从而形成重组的DNA分子或DNA与RNA的杂合分子。这样Vaccinia DNA Topoisomerase I酶就可作为一种体外DNA连接的新型工具，用于DNA载体和重组片段的连接、缺刻修复、接头连接等。
Vaccinia DNA Topoisomerase I可用于解开双链闭合环状DNA的超螺旋结构便于后续的酶切等分子生物学反应、DNA载体和PCR扩增片段之间的连接、缺刻修复和接头连接等。
Vaccinia DNA Topoisomerase I通过大肠杆菌重组、表达和纯化而获得。
一个单位是指在37℃条件下，30分钟内将1μg超螺旋闭合环状pUC18 DNA转化为松弛闭合环状形式所需的酶量。
| 组分 | 200U | 1000U | 5000U |
| 牛痘DNA拓扑异构酶I(10U/μL) | 20μL | 100μL | 500μL |
| 10×Reaction Buffer | 400μL | 2mL | 10mL |
| Storage Buffer | 200μL | 1mL | 5mL |
保存：-20℃
50mM Tris-HCl (pH7.5),1mM DTT,0.1mM EDTA,0.1M NaCl,0.1% Triton X-100 and 50% (v/v) glycerol
10×Reaction Buffer：
500mM Tris-acetate,1M NaCl,25mM MgCl2,1mM EDTA,pH7.5@25℃。
未检测到Vaccinia DNA Topoisomerase I活力之外的DNA外切酶、DNA内切酶和RNase活性。
80℃加热20min可以使Vaccinia DNA Topoisomerase I失活。
当超螺旋质粒用Vaccinia DNA Topoisomerase I处理后，应使用不含溴化乙锭(EtBr，简称EB)的琼脂糖凝胶进行电泳，必须在电泳完成后再使用溴化乙锭或其它合适的核酸染料进行凝胶的核酸染色检测。因为当凝胶中含有溴化乙锭时，溴化乙锭会结合到DNA的碱基之间并催化形成超螺旋。而在电泳结束后再进行染色，即使再次催化形成了超螺旋，也不会改变核酸片段的电泳位置了。
图2．百奥莱博的Vaccinia DNA Topoisomerase I解旋1μg超螺旋pUC18质粒的效果图。分别使用1μg超螺旋pUC18质粒和不同量的Vaccinia DNA Topoisomerase I (0U,2U,1U,0.67U,0.5U,0.25U,0.125U)在含有1×Reaction Buffer的20μL反应体系中，37℃孵育30min，然后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后进行凝胶的核酸染色和拍照。如图所示，随着酶量的增加，1μg超螺旋pUC18质粒可以被1U的Vaccinia DNA Topoisomerase I在30min内完全解旋。M,DNA Ladder(200bp～12kb)。
- 溶解并混匀反应所需的各种溶液。将Vaccinia DNA Topoisomerase I置于冰浴上或冰盒内。
- 参考下表设置反应体系(以20μL体系为例)：
成分 用量 终浓度 无核酸酶水 15.9μL - 10×Reaction Buffer 2μL 1× DNA(0.5μg/μL) 2μL 50ng/μL 牛痘DNA拓扑异构酶I(10U/μL) 0.1μL 0.05U/μL 总体积 20μL -
注：如果酶浓度过高，可适当使用本制品提供的Storage Buffer将酶适当稀释后再使用。 - 将上述配制好的反应体系置于PCR仪或水浴，37℃孵育30min，然后放置冰上。
注：使用PCR仪孵育时，需要调整热盖温度为40℃左右，避免在孵育过程中造成酶失活。 - 使用不含溴化乙锭(EtBr)的适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后进行核酸染色和凝胶成像观察。
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