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Klenow片段图片
产品货号:
YTB4165
中文名称:
Klenow片段
英文名称:
Klenow Fragment
产品规格:
200U|1000U|5000U
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

Klenow Fragment又称Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I (E.coli.DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)。Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。Klenow Fragment的3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性(proofreading),本制品。




对于5'突出或3'突出的粘末端都可以催化产生平末端,用于后续的平端连接。


双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的补平(fill-in);双链DNA 3'突出(3'overhang)末端的打平(也称削平);5'突出末端的标记;随机引物法进行DNA标记;Sanger双脱氧法进行DNA测序;cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。


由大肠杆菌表达,表达基因的来源为polA基因片段。


37℃ 30分钟时间内,催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件:67mM potassium phosphate (pH7.4),6.7mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,0.033mM dATP,0.033mM dTTP,0.4MBq/ml [3H]-dTTP,62.5μg/mL poly(dA-dT)·poly(dA-dT).


组分200U1000U5000U
Klenow Fragment (5U/μL)40μL200μL1mL
10×Reaction Buffer200μL1mL5mL

保存:-20℃


25mM Tris-HCl (pH7.5),0.1mM EDTA,1mM DTT,50% (v/v) glycerol。


10×Reaction Buffer:
500mM Tris-HCl,50mM MgCl2,10mM DTT,pH8.0@25℃。


不含DNA内切酶,不含RNase;单体分子量约68kDa


75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment失活。金属离子螯合剂,无机焦磷酸盐(PPi),大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment有抑制作用。


  • 双链DNA 5'突出末端的补平:
    • 对于双链DNA 5'突出末端的补平,参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
      成分用量终浓度
      Nuclease-Free Water(16.6-x)μL-
      dsDNA with 5'OverhangxμL~0.5μM or 5~200ng/μL
      10×Reaction Buffer2μL
      dNTP Mix (2.5mM each)0.4μL50μM
      Klenow Fragment(5U/μL)1μL0.25U/μL
      总体积20μL-
      • 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体;如果同时进行多个反应,可以把上表中除dsDNA with 5'overhang之外的所有溶液和酶提前混合,分装到各反应管,最后再加入dsDNA with 5'overhang。
      • dsDNA with 5'Overhang如果是寡核苷酸,最终浓度可以约为0.5μM,如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5~200ng/μL。
    • 反应条件:37℃孵育10分钟。
    • 终止反应:75℃孵育10分钟以终止反应。
  • 双链DNA 3'突出末端的打平:
    • 具有3'突出末端的杂交双链DNA的退火。
      将单链DNA 1和DNA 2等摩尔数混合,推荐的终浓度为10μM,95℃孵育2min,然后通过梯度降温至25℃退火形成具有3'突出末端的杂交双链DNA。推荐使用DNA寡核苷酸退火缓冲液,并按照该产品使用说明进行退火反应(退火后的双链DNA推荐在-20℃保存)。
    • 对于双链DNA 3'突出末端的打平,参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
      成分用量终浓度
      Nuclease-Free Water(17-x)μL-
      dsDNA with 3' OverhangxμL~0.5μM or 5~200ng/μL
      10×Reaction Buffer2μL
      Klenow Fragment (5U/μL)1μL0.25U/μL
      总体积20μL-
      • 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体;如果同时进行多个反应,可以把上表中除dsDNA with 3'overhang之外的所有溶液和酶提前混合,分装到各反应管,最后再加入dsDNA with 5'overhang。
      • dsDNA with 3'Overhang如果是寡核苷酸,最终浓度可以约为0.5μM,如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5~200ng/μL。
    • 37℃孵育10分钟。
    • 75℃孵育10分钟以终止反应。
  • 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的标记:
    • 参考如下表格设置反应体系:
      成分用量
      dsDNA with 5'Overhang10~15μL (0.1~4μg)
      10×Reaction Buffer2μL
      [α-32P]-dNTP,~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)
      或[α-32P]-dNTP,~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)
      0.74 MBq (20μCi)
      或2.96 MBq (80μCi)
      3 dNTP Mixture (2.5mM each,without the labeled dNTP)2μL
      Klenow Fragment0.2μL(1U)
      无核酸酶去离子水至20μL
    • 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
    • 30℃孵育15分钟。
    • 75℃孵育10分钟终止反应。
  • 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。

相关搜索:Klenow片段大肠杆菌聚合酶IDNA聚合酶Klenow Fragment
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