Poly(A)聚合酶加尾试剂盒

产品货号：

YTB4154

中文名称：

Poly(A)聚合酶加尾试剂盒

英文名称：

Poly(A)Polymerase Tailing Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是一种基于E.coli Poly(A) Polymerase的活性在ATP存在的情况下将Poly(A)尾快速而有效地添加到单链RNA的3'-OH末端的试剂盒。

本试剂盒主要用于在RNA分子3'末端添加≥150个碱基的Poly(A)尾。Poly(A)尾的添加可提高RNA在真核细胞中的稳定性并增强其在转染或显微注射后的翻译效率。此外，Poly(A)尾还可以为合成cDNA时提供通用的引物结合位点，或用于RNA的末端标记或mRNA的定量。

如果RNA分子的3'末端是磷酸，可以使用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)，在没有ATP存在的情况下催化去除3'端磷酸。在加Poly(A)尾之前，可以通过柱纯化(如柱式动物小RNA提取试剂盒)或切胶回收等方法去除T4 PNK及相应的反应体系组分。

提高mRNA在真核细胞中的稳定性，提高转染或显微注射后真核细胞中RNA的翻译效率；在合成cDNA第一链时，提供引物结合位点；将放射性标记的腺苷添加到RNA分子的3’末端。

使用效果

图1.本试剂盒对单链RNA添加Poly(A)尾的效果图。在100μL反应体系(50mM Tris-HCl,pH8.1,250mM NaCl,1mM ATP,10mM MgCl₂)中，加入人工合成的1μg 22nt的单链RNA，以及图中指定量的Poly(A) Polymerase，37℃孵育60min，65℃孵育20min终止反应。取20μL反应后的产物，加入4μL 6×DNA上样缓冲液，95℃变性3min。随后进行含7M Urea的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温条件下用1×TBE作为电泳液，180V电泳90min，NadRed红色核酸染料 1:1000稀释后室温染色15min，然后拍照观察。

产品组成

组分	规格
E.coli Poly(A) Polymerase (5U/μL)	100μL
10×PAP Reaction Buffer	600μL
10mM ATP	600μL
Nuclease-free water	1mL

保存：-20℃，有效期2年。

规格说明

本试剂盒如果用于100μL的反应体系，可以进行50次Poly(A)加尾反应；本试剂盒如果用于20μL的反应体系，可以进行250次Poly(A)加尾反应。

注意事项

反应的终止取决于加Poly(A)尾后RNA分子的后续用途。可以有多种方式终止Poly(A)加尾反应，如立即将完成的反应置于-20℃或-80℃条件下冷冻，通过有机溶剂萃取(例如苯酚/氯仿抽提)去除Poly(A) Polymerase或使用EDTA等试剂螯合Mg²⁺以抑制酶活性。使用本试剂盒时，不推荐对Poly(A) Polymerase进行热变性以终止反应，因为这样可能会导致RNA降解。
如果需要在体外或体内进行翻译，可以预先通过苯酚/氯仿抽提及乙醇或醋酸铵沉淀，或柱纯化已经添加了Poly(A)尾的RNA。

参考下表在冰浴中设置反应体系。参考下表100μL反应体系中加Poly(A)尾的RNA底物量可以高达60μg，并且可根据实验需要按比例放大或缩小反应体系。在Poly(A)加尾反应中，加尾的长度取决于RNA 3'-OH末端的摩尔浓度、反应时间、酶量和ATP浓度。可以通过更改一个或多个因素来调整加尾的长度。按照如下的推荐反应体系，在37℃孵育60min，加Poly(A)尾长度可以超过150个碱基。

成分	用量	终浓度
DEPC-treated Water	(75.5-x)μL	-
10×PAP Reaction Buffer	10μL	1×
10mM ATP	10μL	1mM
RNase Inhibitor(40U/μL)	2.5μL	1U/μL(可选)
RNA	xμL	0.01～0.6μg/μL
E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μL)	2μL	0.1U/μL
总体积	100μL	-

由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。
用于加尾反应的RNA在使用前应进行适当的纯化，并溶解于nuclease free water中，且溶液中应不含EDTA和盐分。
如果较难确保比较严格的RNase-free，推荐在上述反应体系中添加0.5μL RNase抑制剂，以提高溶液中RNA的稳定性。

加尾反应：37℃孵育30～60min。
反应终止：反应完成后立即-20℃保存，或加入EDTA至终浓度为10mM，或者使用苯酚/氯仿抽提并使用铵盐/乙醇沉淀RNA。
Poly(A)加尾产物的电泳鉴定：配制与RNA分子大小相对应比例的变性琼脂糖-甲醛凝胶。使用厚度为0.75mm(或更薄)的凝胶以获得最佳的分辨率。RNA长度小于500nt时，建议使用2.5%的琼脂糖凝胶；RNA分子大于500nt时建议使用1%的琼脂糖凝胶。RNA样品75℃变性10min，用1×MOPS缓冲液，以5v/cm的电压进行凝胶电泳，直至溴酚蓝染料迁移至接近凝胶底部。电泳检测时，RNA样品中宜含有10mM或更高浓度的EDTA，否则RNA较容易出现降解。

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