UDG酶

产品货号：

YTB4034

中文名称：

UDG酶

英文名称：

Uracil-DNA Glycosylase(E.coli)

产品规格：

1000U|5000U

发货周期：

1～3天

产品价格：

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UDG酶可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶。UDG酶可以水解含有dU的单链或双链DNA，但不能水解RNA或含有dU的长度不超过6个碱基DNA寡聚体。

UDG酶主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：
在PCR反应中加入适量的dUTP，以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成含dU碱基的PCR扩增产物；后续进行PCR反应时，使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA，从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。

产品用途

防止PCR产物的交叉污染；
单核苷酸多态性检测(single nucleotide polymorphism detection，GMPD)；
位点特异性突变；
蛋白质与DNA相互作用研究；
SNP基因分型；
PCR产物的克隆；
制备含有单链突出末端的PCR产物或cDNA。

组分	1000U	5000U
E.coli UDG(5U/μL)	200μL	1mL
10×E.coli UDG Buffer	2mL	10mL

保存：-20℃，有效期1年。

酶储溶液

10mM Tris-HCl (pH7.4)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1mg/mL BSA，50% (v/v) glycerol。

活性定义

一个活性单位是指37℃条件下，50μL反应体系中，一分钟内催化从0.2μg含有尿嘧啶的双链DNA中释放60pmol尿嘧啶所需的酶量。

缓冲体系

10×E.coli UDG Buffer：
200mM Tris-HCl，10mM EDTA，10mM DTT，pH8.0@25℃。

产品来源

大肠杆菌重组、表达和纯化而获得。

质量控制

不含UDG酶活力之外的内切或外切脱氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。

失活抑制

95℃加热10分钟可以使95% E.coli UDG失活。由于经95℃加热10分钟处理后，其仍保持部分活性，建议加入UDG抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2的Ugi蛋白或噬菌体phi29的p56蛋白)进一步抑制其酶活以免其继续降解含有dU的PCR产物。

使用效果

E.coli UDG酶活性鉴定结果可参考图1。
UDG酶

图1.本制品和N公司E.coli UDG酶催化水解5μL含dU碱基的PCR扩增产物效果图。使用本制品或国外N公司的E.coli UDG，在20μL体系，分别以5μL含dU碱基的1600bp大小的PCR扩增产物为底物和不同量的(0U,0.0025U,0.005U,0.01U,0.025U,0.5U) E.coli UDG在1×E.coli UDG Buffer，37℃孵育30min，然后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有相当的酶活。M：DNA Ladder(200bp～12kb)。

注意事项

E.coli UDG酶在大多数PCR反应缓冲液体系中均有活性，但对于自行使用的PCR或RT-PCR体系，首次使用时建议先测试一下是否和所使用的体系兼容。通常取含dUTP的PCR扩增产物，参考图1加入适量UDG，观察能否有效降解含dUTP的PCR扩增产物。
dNTP/dUTP推荐选购dNTP/dUTP混合液(2.5mM/5mM)。
E.coli UDG酶消化产生的DNA链的无碱基位点可通过加热，碱处理或核酸内切核酸酶处理而除去。通常PCR反应过程中的加热步骤可以确保UDG酶消化的位点被完全剪切开。
E.coli UDG酶在比较宽泛的pH范围内具有活性，其最适pH值为8.0，E.coli UDG酶活不需要二价阳离子，并被高离子强度(> 200mM)所抑制。
E.coli UDG酶可以在PCR反应前清除不慎污染的含dUTP的PCR产物，从而避免由于污染导致的PCR假阳性结果。
E.coli UDG在加热变性后可能由于重折叠而在较低温度下表现出残留活性。因此，建议在退火步骤中使用55℃或更高的温度进行后续PCR。
E.coli UDG可以用于DNA或cDNA的常规PCR或qPCR扩增体系，但通常不建议用于RT-PCR体系。因为在反转录条件下，通常E.coli UDG会保持活性，并可能消化新合成的cDNA。
E.coli UDG酶经95℃加热10min处理后，仍会保持少量活性，如果希望用于RT-PCR体系，需要反转录和PCR分开进行，在反转录时不使用dUTP，在反转录后加入E.coli UDG酶处理，然后进行常规的PCR或qPCR，或者建议加入UDG抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2的Ugi蛋白或噬菌体phi29的p56蛋白)进一步抑制E.coli UDG的酶活性。

参考下表设置PCR反应体系，或者参考所使用的PCR扩增体系设置PCR体系，并加入E.coli UDG酶至终浓度为0.01U/μl。通常仅加入PCR buffer即可，无需加入UDG的buffer。

成分	25μL体系	50μL体系	终浓度
Nuclease-Free Water	(18.325-x)μL	(36.65-y)μL	-
10×PCR Buffer (with Mg²⁺)	2.5μL	5μL	1X (1.5mM Mg²⁺)
dNTP/dUTP (2.5mM each/5mM)	2μL	4μL	0.2mM each/0.4mM
Primer mix (10μM each)	2μL	4μL	0.8μM
Template	xμL	yμL	10pg～1μg
Taq DNA Polymerase (5U/μl)	0.125μL	0.25μL	-
E.coli UDG (5U/μL)	0.05μL	0.1μL	-
总体积	25μL	50μL	-

根据实验需要，dNTP/dUTP的终浓度可在0.2～0.6mM之间调整。镁离子的最终终浓度可在1.0～4.0mM之间调整。
对于25μL的PCR反应体系，E.coli UDG(5U/μL)的使用量一般为0.25～0.5U。
模板和引物的用量请参考Taq DNA聚合酶使用说明或相应的PCR体系的产品说明书。

参考上述反应体系，加入E.coli UDG后混匀，37℃孵育10min (本步骤可以有效去除可能的之前含dUTP的PCR扩增产物的污染)，后续就可以立即进入PCR扩增程序(须确保退火温度不低于55℃)。根据我们的实际测试结果发现，在退火温度不低于55℃的情况下，使用本制品的情况下不会影响PCR扩增的产物量。

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