产品货号:
YTB4028
中文名称:
T4 RNA连接酶II(截短型)
英文名称:
T4 RNA Ligase II,truncated
产品规格:
5kU|20kU|100kU
发货周期:
1~3天
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本制品为T4 RNA连接酶II截短型(T4 Rnl2tr),该酶仅包含T4 RNA连接酶II的N端249个氨基酸,可特异性地将5'端预腺苷酰化的DNA或RNA (App-DNA或App-RNA)连接到RNA的3'羟基。
T4 RNA连接酶II截短型(T4 Rnl2tr)与T4 RNA连接酶II(T4 Rnl2)的酶活性完全不同,后者是一种ATP依赖的dsRNA ligase,而前者是一种不依赖于ATP的,依赖于5'端预腺苷酰化的单链核酸连接酶。
T4 RNA连接酶II(截短型)常用于microRNA (miRNA)等3'端为羟基的单链RNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时,在3'羟基端添加5'端预腺苷酰化的DNA或RNA接头。
T4 Rnl2tr只能利用5'端预腺苷酰化的单链DNA或RNA作为3'端接头,因此可以大大降低连接反应的背景,通常是小RNA等建库时的优先选择。
T4 Rnl2tr连接时不需要ATP,但需要5'端预腺苷酰化(也称预腺苷化、腺苷酰化或腺苷化)底物。即使在有ATP存在的情况下,T4 Rnl2tr也不能催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。而T4 RNA Ligase I可以在ATP存在的情况下,催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。因此T4 Rnl2tr特别适用于small RNA library的制备,不管是进行miRNA的测序还是进行directional mRNA-Seq,该酶都可以提高建库的质量,并有效降低连接反应的背景。
- 5'末端预腺苷酰化的单链DNA或者RNA与单链RNA的3'羟基末端连接;
- cDNA文库构建中连接5'末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和小RNA;
- 链特异性的cDNA文库构建中连接5'末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和RNA;
- 二代测序中,miRNA文库构建中RNA的3'末端与接头之间的连接;
- cDNA文库的构建以进行小RNA转录组分析(small-RNA transcriptome analysis)。
大肠杆菌表达的重组蛋白,表达基因为T4嗜菌体T4 RNA连接酶II N端1-249位的氨基酸。
200单位是指10μL反应体积中,25℃条件下,1小时内将31-mer RNA的80%连接到17-mer DNA的预腺苷化端所需要的酶量。
组分 | 5kU | 20kU | 100kU |
T4 Rnl2tr(200U/μL) | 25μL | 100μL | 500μL |
10×T4 Rnl2tr Buffer | 75μL | 300μL | 1.5mL |
PEG8000(50%,RNase-free) | 400μL | 1.5mL | 7.5mL |
保存:-20℃,有效期1年。
10mM Tris-HCl(pH7.5),100mM NaCl,0.1mM EDTA,0.1mM DTT,50% (v/v) Glycerol。
65℃加热20min可使T4 Rnl2tr失活,或加入蛋白酶K或EDTA也可以抑制其活性。
无DNA内切酶和外切酶活性,无RNA酶活性,无蛋白酶活性。
- 本制品提供的试剂均用不含DNA酶和RNA酶的水配制,可直接用于3'端为羟基的单链RNA和5'端腺苷酰化的DNA或RNA之间的连接反应。
- 可根据具体应用选择合适的操作方法,可能需准备额外的试剂,如百奥莱博的RNase抑制剂、DEPC水等。
- 使用本制品连接ssRNA和AppDNA时,建议使用的PEG8000(货号:YTB0616)的浓度为10%~30%,适当提高PEG8000的浓度,会显著提高T4 Rnl2,truncated的催化的连接效率,而不改变其反应特性。
使用本制品催化连接AppDNA和ssRNA的效果请参见图1。
图1.本制品和国外N公司的同类产品催化连接AppDNA和ssRNA的效果图。使用本制品或竞品,在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或竞品,25℃孵育60min进行连接反应,反应完毕后立即取样在65℃孵育20min终止反应,加入变性上样缓冲液,在95℃孵育5min后放至冰浴中,随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析,最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示,本制品与竞品相比,具有类似的催化效果。
- 用于连接5'端腺苷酰化并且3'端不是羟基的(例如为氨基)单链DNA (AppDNA-NH2)和3'端为羟基的单链RNA (ssRNA)的使用说明具体如下。需要提前准备好待连接的样品,以及Universal miRNA Cloning Linker或自备的适当接头。
- 参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
成分 组分 终浓度 ssRNA x μL 0.5 or 1μM DEPC-treated Water (4-x-y)μL - Universal miRNA Cloning Linker y μL 1 or 0.5,or 2 or 1μM PEG8000 (50%,RNase-Free) 12μL 0.3 10×T4 Rnl2tr Buffer 2μL 1× RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL 2U/μL T4 Rnl2tr(200U/μL) 1μL 10U/μL 总体积 20μL - - 由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase Inhibitor,以避免ssRNA或其连接产物的降解,尽管经测试我们发现在严格操作的情况下,不加RNase Inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
- 进行连接反应时,如果样品RNA比较珍贵,希望充分被连接,可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接;如果样品RNA比较充裕,同时感觉接头的成本偏高时,可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应,这样可以很好地节省接头。ssRNA的用量可以根据实际的样品量进行适当调节,相应的接头的用量也按照比例进行适当调整即可。
- 如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
- 由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase Inhibitor,以避免ssRNA或其连接产物的降解,尽管经测试我们发现在严格操作的情况下,不加RNase Inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
- 连接反应:25℃,孵育60min。为了使连接反应更加充分,可以适当延长连接反应时间。
- 终止反应:65℃,孵育20min。
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