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Faustovirus加帽酶(Faustovirus Capping Enzyme,FCE)是表达、纯化获得的一种来自Faustovirus S17菌株的单亚基mRNA加帽酶。FCE具有给mRNA添加Cap-0帽结构所需的三种酶活性，即三磷酸酶(TPase)、鸟嘌呤转移酶(GTase)和(鸟嘌呤-N7)-甲基转移酶(N7 MTase)的活性，它可在真核生物mRNA的5'末端的三磷酸和二磷酸位置催化加入N7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppNp)，从而产生带有Cap-0帽结构的mRNA。

与牛痘病毒加帽酶(VCE)相比，FCE具有更宽的反应温度范围和更高的酶活性，且在37℃和高至55℃的温度下都能够具备加帽活性。FCE与mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶协同作用，可一步添加Cap-1帽结构至mRNA。真核生物mRNA Cap-0和Cap-1帽结构的添加以及poly(A)加尾对于其成熟至关重要，其中Cap-0帽结构可以通过保护mRNA免遭5'→3'核糖核酸外切酶降解以增加mRNA稳定性，还可防止三磷酸化的mRNA激活机体的天然免疫反应。

图1．Faustovirus加帽酶对mRNA添加Cap-0帽结构的原理图。首先，FCE通过其RNA三磷酸酶活性将mRNA 5'-三磷酸(5'pppN－)裂解为二磷酸(5'ppN－)；然后，FCE通过其RNA鸟苷酸转移酶活性将GTP连接到mRNA N1的5'-二磷酸形成未甲基化的G帽结构(5'GpppN－)；最后，FCE通过其鸟嘌呤7-甲基转移酶活性，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，催化G帽的N7位置的甲基化，最终产生带有Cap-0帽结构的mRNA。

• 体内或体外翻译前mRNA的加帽；
  
• mRNA的5'末端标记。

组分	500U	2500U
Faustovirus加帽酶(25U/μL)	20μL	100μL
10×Capping Buffer	100μL	500μL
10mM GTP	30μL	150μL
32mM SAM	10μL	50μL

保存：-20℃，有效期1年。


40mM Tris-HCl (pH8.0@25℃)，100mM NaCl，50mM Arginine，0.1mM TCEP，50% Glycerol。


10×Capping Buffer：
500mM Tris-HCl(pH8.0@25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，0.2% Poloxamer 188。


由大肠杆菌表达Faustovirus Capping Enzyme基因，经纯化而获得。


一个活性单位是指在37℃条件下，30分钟内将75pmol的20-mer transcript转化为Cap-0帽RNA所需的酶量。


70℃加热10分钟可使Faustovirus加帽酶失活。


纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

• 本制品使用时宜放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
  
• 由于涉及RNA操作，须严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染。
  
• 实验中用到的吸头、离心管等实验耗材必须为RNase-free的或须经DEPC处理，不含RNase的超纯水推荐使用无菌无酶超纯水或无酶DEPC水。
  
• 桌面等环境以及仪器设备表面的RNase、DNase、RNA和DNA的去除推荐使用核酸酶/RNA/DNA喷雾清除剂进行快速处理。
  
• 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase Inhibitor、超纯水等。
  
• SAM在pH值为7～8，37℃条件下不稳定，建议在反应开始前根据实际反应数配制新鲜的工作液并放置于冰上，防止SAM降解。

• FCE对mRNA添加Cap-0帽结构：
  
  • DNA模板的制备。带有T7 Promoter或其它适当启动子的线性化质粒DNA、PCR产物或合成的DNA片段等均可以作为体外转录的模板。
    
  • mRNA的制备。使用T7 RNA聚合酶(YT409/YTB4179/YTB4180)和100mM ATP、100mM CTP、100mM GTP及100mM UTP，或T7体外转录试剂盒，或T7快速体外转录试剂盒或其它启动子对应的酶或试剂盒转录获得mRNA。
    
  • SAM (2mM)的配制。在反应开始前根据实际反应数配制新鲜SAM工作液。将32mM SAM分装并用无菌无酶超纯水稀释至2mM，放置于冰上备用。
    
  • 对mRNA添加Cap-0帽结构的反应体系的设置。请参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
    

    成分	用量	终浓度
    超纯水	(37-x)μL	-
    mRNA	x μL	达1μg/μL
    65℃加热5min，然后立刻立即在冰浴中孵育。
    RNase抑制剂(40U/μL)	1μL	0.8U/μL
    10×Capping Buffer	5μL	1×
    10mM GTP	2.5μL	0.5mM
    2mM SAM	2.5μL	0.1mM
    Faustovirus加帽酶(25U/μl)	2μL	1U/μL
    总体积	50μL	-

    • 如果只进行一个反应，请把除Faustovirus Capping Enzyme以外的组分充分混匀后，再加入Faustovirus Capping Enzyme；如果同时进行多个反应，可以把上表中除mRNA之外的所有溶液和酶提前预混合后分装到各反应管内，再加入65℃变性5分钟后立即置于冰浴中的mRNA，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀，或用Vortex在最低速度轻轻混匀)后低速离心沉淀液体。
      
    • 本反应体系中涉及RNA，可以酌情适量添加鼠源RNase抑制剂、RNase抑制剂、重组人RNase抑制剂或人RNase抑制剂。
      
    • 在与FCE温育前，将mRNA溶液在65℃加热5分钟以打开转录产物5'末端的二级结构。对于5'末端高度结构化的转录产物，可将时间延长至10分钟或适当提高变性温度。
    • SAM在pH值为7～8，37℃条件下不稳定，建议在反应开始前再配制新鲜的工作液并将其放置于冰上，防止SAM降解。
    • 对于5'末端结构化的转录产物，可将反应时间适当延长以提高加帽效率。
    • 标记5'末端时，GTP总浓度应为反应中mRNA摩尔浓度的1～3倍。可以将10mM GTP酌情稀释并掺入一定量的经荧光探针、生物素等标记的GTP以制成GTP混合物。
    • FCE也可与mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶协同作用，可一步添加Cap-1帽结构至mRNA。
  • 反应条件：37℃孵育60分钟。对于长度小于200nt的RNA，宜将孵育时间延长至2小时或减少底物的用量。
    
  • 终止反应：70℃加热10分钟可使Faustovirus加帽酶失活。
    
  • 反应后可通过质谱分析或者细胞转染进一步检测加帽效率。
• 其它应用请参考相关文献资料进行。

图2．百奥莱博的Faustovirus加帽酶和N公司的同类竞品催化EGFP mRNA的5'末端形成Cap-0帽结构，然后将该mRNA转染293T细胞表达EGFP蛋白的效果图。在25μL反应体系(50mM Tris-HCl (pH8.0@25℃),5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,0.02% Poloxamer 188,5μg EGFP mRNA,0.8U/μL RNase抑制剂(YTB3151/YT530/YTB3150/YTB4648),0.5mM GTP,0.1mM SAM)中分别加入25U的本制品或N公司的FCE，37℃孵育60分钟反应生成Cap-0帽结构，70℃孵育10分钟以终止反应。25万个293T (人胚肾细胞)在细胞培养板中培养24小时，每孔使用LP8000转染试剂转染500ng未添加或添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA，继续培养24小时后使用荧光显微镜进行拍照。如图所示，本品与N公司的竞品相比，具有类似的催化效果。A和B分别为不加帽EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；C和D分别为使用本制品添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；E和F分别为使用N公司的Faustovirus Capping Enzyme添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片。EGFP mRNA的制备方法：首先以带有T7 Promoter的EGFP完整编码序列的线性化质粒DNA为模板，使用T7 RNA聚合酶(YT409/YTB4179/YTB4180)和100mM ATP、100mM CTP、100mM GTP以及UTP溶液，或T7体外转录试剂盒，或T7快速体外转录试剂盒转录获得EGFP mRNA。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
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