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RtcB连接酶是一种可催化单链RNA分子3'末端的3'-磷酸或2',3'-环磷酸与单链RNA分子5'末端的5'-羟基连接的酶。RtcB RNA连接酶的催化连接反应需GTP、MnCl2的参与，并在反应过程中生成GMP，用于底物3'-磷酸末端的活化和连接；对于末端是2',3'-环磷酸的底物，须先将末端水解为3'-磷酸基团，再由GMP进行活化连接

• RtcB RNA连接酶主要用于单链RNA分子之间的连接或单链RNA的环化，连接时需要3'-磷酸或2',3'-环磷酸基团和5'-羟基的存在。
  
• RtcB RNA连接酶也可以用于DNA (Donor)和DNA (Acceptor)、RNA (Donor)和DNA (Acceptor)之间的连接，但连接效率非常低。
  
• RtcB RNA连接酶主要用于3'-磷酸或2',3'-环磷酸末端的单链RNA/DNA分子与5'-羟基末端的单链RNA分子的连接；
  对于单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间的连接，推荐使用T4 RNA连接酶I或T4 RNA连接酶；
  对于双链RNA的连接，推荐使用T4 RNA连接酶II；
  对于5'端预腺苷酰化的DNA或RNA (App-DNA或App-RNA)与3'端羟基的RNA的连接，推荐使用T4 RNA连接酶II(截短型)或T4 RNA连接酶II(截短型，R55K和K227Q突变)。

• 用于末端为3'-磷酸或2',3'-环磷酸的ssRNA或ssDNA分子与末端为5'-羟基的ssRNA的连接；
  
• ssRNA的环化；
  
• 使用标记探针检测末端为3'-磷酸、2',3'-环磷酸或5'-羟基的RNA。

组分	25T	100T	500T
RtcB Ligase(15μM)	25μL	100μL	500μL
10×Reaction Buffer	60μL	250μL	1.2mL
GTP(1mM)	60μL	250μL	1.2mL
MnCl2(10mM)	60μL	250μL	1.2mL

保存：-20℃，有效期1年。


10mM Tris-HCl(pH7.4@25℃)，50mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，50% Glycerol。


10×Reaction Buffer：500mM Tris-HCl(pH8.3@25℃)，30mM MgCl₂，750mM KCl，100mM DTT。


纯化自携带编码大肠杆菌RtcB Ligase基因的E.coli重组菌株。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

• 本制品提供的试剂均用不含DNA酶和RNA酶的水配制，可直接用于3'端为磷酸或2',3'-环磷酸的ssRNA/ssDNA和5'端为羟基的ssRNA之间的连接反应。
  
• 本制品连接的底物需要确保5'末端是羟基，同时3'末端是磷酸或2',3'-环磷酸。此外，反应体系中必须加入GTP、MnCl2。
  
• 如果连接底物为双链RNA或DNA，推荐使用T4 RNA连接酶II等系列产品。
  
• 如果连接底物是5'末端磷酸化或腺苷酰化、3'末端是羟基的ssRNA或ssDNA，推荐使用T4 RNA连接酶I等系列产品。
  
• 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如DEPC水(不含RNase、DNase和蛋白酶)、无菌无酶超纯水、RNase抑制剂(YTB3151/YT530/YTB3150/YTB4648)等。
  
• 使用本制品进行连接反应时，如果底物过多或过少，在反应体系中加入PEG8000至终浓度为15%很多情况下可以显著提高连接效率，同时不影响反应特性。推荐使用PEG8000。
  
• 本制品使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

图1．RtcB连接酶催化连接ssRNA的效果图。在20μL反应体系(50mM Tris-HCl，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT (pH8.3@25℃))中加入10pmol长度为20nt的ssRNA (5'-OH-UGGCUCCGAUAUCACGCUUCp-3')，适量无菌无酶超纯水，以及最终浓度为图中所示的本制品或N公司(竞品)的RtcB连接酶，37℃孵育1小时进行反应。取反应后产物5μL，加入5μL 2×DNA/RNA上样缓冲液，进行15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60分钟)，随后使用NadRed(货号：YT015/YT015)室温染色5分钟，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，本制品与N公司的RtcB连接酶相比，具有类似的连接ssRNA的效果。Inter-ligated product为分之间连接的产物，Intra-ligated product为分子内连接形成的环形小RNA。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 参考下表在冰浴中配制如下反应体系(以20μL体系为例)：
  

  成分	用量	终浓度
  超纯水	(13－X－Y)μL	-
  10×Reaction Buffer	2μL	1×
  GTP(1mM)	2μL	0.1mM
  MnCl2(10mM)	2μL	1mM
  3'-phosphate ssRNA	X μL(10pmol)	0.5μM
  5'-OH ssRNA	Y μL(10pmol)	0.5μM
  RtcB Ligase(15μM)	1μL	0.75μM
  总体积	20μL	-

  • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，相关试剂和耗材须避免RNase污染，确保是RNase free的，推荐使用无菌无酶超纯水进行反应体系的配制。由于涉及RNA操作，考虑到实际操作时的环境可能存在RNase污染，推荐适量添加RNase抑制剂(YTB3151/YT530/YTB3150/YTB4648)，尽管我们实测不添加RNase抑制剂时也可以获得良好的连接效果。
  • 上述表格中ssRNA的用量已经比较大，对于样品比较少的情况下，完全可以大幅减少ssRNA的用量。
  • 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除底物之外的所有溶液和酶提前预混合，然后分装到各反应管内，最后加入底物。
  • 对于过多或过少底物的连接，可通过在反应体系中加入最终浓度为15%的PEG8000，以增强连接效果。
  • 为获得最好的底物连接效果，也可根据实际情况调整底物与RtcB Ligase的加入量，摸索最优酶促连接反应体系。
  • RtcB Ligase的酶促连接反应须GTP和MnCl2的参与，请务必在反应体系中添加终浓度为0.1mM GTP和1mM MnCl2，以保证连接反应的正常进行。
• 按上表配制好反应体系后，适当轻轻混匀反应体系，随后低速离心使粘附在管壁上的液体沉至管底。
  
• 反应条件：37℃孵育1小时。
  
  • 反应时间可以根据实际情况酌情适当调整。
• 取连接后产物进行聚丙烯凝胶电泳，拍照观察并分析连接效果。
  
• 建议将反应产物通过离心柱式纯化或苯酚/氯仿萃取后乙醇沉淀的方式，对连接产物进行纯化后再用于后续实验。
  
• 其它用途请自行根据实验目的，查阅相关文献资料进行。

• 底物的二级结构或形成了双链RNA是否可能影响RtcB Ligase的连接效果？
  是的。RtcB Ligase连接反应中，底物3'端和5'端都须为单链，并且二级结构不能影响单链末端的暴露，以保证连接反应有效进行。
  
• RtcB Ligase可以催化DNA底物的连接吗？连接效率如何？
  是的。RtcB Ligase可用于DNA (Donor)和DNA (Acceptor)、RNA (Donor)和DNA (Acceptor)之间的连接，但连接效率非常低。
  
• RtcB Ligase的最佳反应温度是多少？
  RtcB Ligase在37℃条件下具有最佳酶活和连接效果。
  
• 可以采用哪些方式提高RtcB Ligase的酶促连接效率？
  可以通过在反应体系中加入更多的RtcB Ligase、适量添加PEG8000或延长连接反应时间的方式，来提高RtcB Ligase的连接效率。
  
• 在RtcB Ligase的反应体系中，可以使用镁或其它二价阳离子替代锰离子进行连接反应吗？
  不可以。RtcB Ligase的连接反应的正常进行必须加入锰离子，不能使用其它二价阳离子代替。
  
• 在反应体系中加入聚乙二醇(PEG)分子可以提高RtcB Ligase的连接效率吗？
  当加入底物的摩尔量等于RtcB Ligase时，在反应体系中加入PEG8000并不会显著提高连接效率；当加入底物的摩尔量超过RtcB Ligase时，在反应体系中添加15%的PEG8000可以显著提高连接效率；当底物量特别少时，添加PEG8000也可能改善连接效率。

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