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SP6 RNA聚合酶是一种高度特异识别SP6启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。SP6 RNA聚合酶可以催化单链或双链DNA SP6启动子下游NTP的掺入，合成与SP6启动子下游的模板DNA互补的RNA。

SP6 RNA Polymerase可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于SP6启动子有高度的特异性。


用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay)，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。


本制品由大肠杆菌表达，表达基因为嗜菌体SP6 RNA聚合酶基因。


37℃60分钟内，催化1nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：
40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl₂，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，0.6MBq/ml[3H]-ATP，20μg/mL plasmid DNA containing the specific SP6 RNA Polymerase promoter sequence。


70℃加热10分钟可使SP6 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使SP6 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制SP6 RNA Polymerase的活性。


SP6的consensus promotersequence如下：
-15 -10 -5 +1 +5
ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG

组分	规格
SP6 RNA Polymerase(20U/μL)	25μL
5×Transcription Buffer	200μL

保存：-20℃


50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/mL BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。


5×Transcription Buffer：
200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl₂，50mM DTT，50mM NaCl，10mM spermidine。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。


一、RNA合成

• DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
  
• 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如产物DNA纯化试剂盒，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
  
• 参考如下表格设置反应体系：
  

  成分	用量
  5×Transcription Buffer	10μL
  NTP Mixture(10mM each)	10μL
  线性DNA模板	1μg
  Ribonuclease Inhibitor	50U
  SP6 RNA Polymerase	30U
  经DEPC处理的去离子水	至50μL

• 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
  
• 37℃孵育1～2个小时。
  
• 加入2μL 0.5M EDTA(pH8.0)到反应体系中混匀或-20℃冷却终止反应。
  
• 电泳分析转录产物，或通过其他适当方法鉴定转录的效率。

• 转录需在无RNA酶条件下进行。
  
• 反应体系需在室温条件下配置，4℃有亚精胺(spermidine)存在时DNA可发生沉淀。
  
• 按以上反应条件，每1μg模板DNA可合成超过10μg的RNA。
  
• 如果模板DNA的线形化不太完全，会导致转录出比预期长度更长的RNA，同时使预期长度的转录本比例下降。
  
• 可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。

二、放射标记RNA的合成

• DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
  
• 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如产物DNA纯化试剂盒，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
  
• 参考如下表格设置反应体系：
  

  成分	用量
  5×Transcription Buffer	4μL
  3 NTP Mixture(10mM each,without CTP)	1μL
  100μM CTP	2.4μL
  [α-32P]-CTP,～30TBq/mmol(800Ci/mmol)	1.85MBq(50μCi)
  线性DNA模板	0.2～1μg
  Ribonuclease Inhibitor	20U
  SP6 RNA Polymerase	20U
  经DEPC处理的去离子水	至20μL

• 37℃孵育1～2个小时。
  
• -20℃冷却终止反应。
  
• 分析和检测RNA的标记效率。

• 按以上方法合成的RNA活性一般为3～5×10⁸dpm/μg。
  
• 上述标记反应中也可以使用[³²P]、[³⁵S]或[³H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时，其他的NTP需作相应调整。20μL反应体系各成分推荐使用剂量分别为：
  1.85MBq(50μCi)5'-[α-³²P]-CTP：~30TBq/mmol(800Ci/mmol)；
  11.1MBq(300μCi)5'-[α-³⁵S]-UTP：＞37TBq/mmol(＞1000Ci/mmol)；
  0.925MBq(25μCi)5,6-[³H]-UTP：1.1～2.2TBq/mmol(30～60Ci/mmol)。
  
• 放射性标记NTP浓度低于12μM时，全长转录本合成效率也会下降。

三、其它用途
可以参考上述用途或相关文献资料进行。
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