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Histan V Reverse Transcriptase是通过基因工程技术得到的全新逆转录酶，其热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Histan V Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10kb的cDNA。广泛应用于一步法RT-qPCR、基因克隆、荧光定量等领域。

组分	10kU	50kU
Histan V Reverse Transcriptase (200U/μL)	50μL	250μL
5×Histan V Buffer	250μL	1.25mL

保存：-20℃，有效期2年。


以Poly(A)·Oligo(dT)为模板-引物，在37℃，10min内，将1nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位。

• 请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；
  
• 所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解；
  
• 为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本；
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

一、第一链cDNA合成操作步骤

• RNA变性
  此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。
  
  • 按下表加入各成分，建立RNA变性反应体系：
    

    成分		用量
    引物	Oligo (dT)18 (50μM)	1μL
    	Random Primers (50μM)	1μL
    	Gene Specific Primers (2μM)	1μL
    模板	Total RNA	1ng～5μg
    	mRNA	1～500ng
    RNase free ddH2O		至13μL

    
    
  • 65℃加热5min，迅速置于冰上冷却2min。
    
  • 简短离心收集反应液后，加入下表中的逆转录反应液，并轻轻吹打混匀。
• 配制逆转录反应体系（20μL）
  

  成分	用量
  上一步的反应液	13μL
  5×Histan V Buffer	4μL
  dNTP Mix (10mM)	1μL
  Histan V Reverse Transcriptase(200U/μL)	1μL
  RNase inhibitor (40U/μL)	1μL

  
  注：该逆转录酶也适用于一步法RT-qPCR，推荐每25μL反应体系，添加10～20U逆转录酶，也可根据实际情况逐步增加逆转录酶用量。
  
• 设置逆转录程序
  

  温度	时间
  25℃	5min
  42℃	15～30min
  85℃	5min

  
  注：
  
  • 当使用Random Primers时，需25℃，孵育5min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略。
    
  • 逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂二级结构的模板，可将逆转录温度提高至50～55℃。
• 85℃加热5min，目的是使逆转录酶失活。
  
• 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

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