产品货号:
SY0893
中文名称:
耐热反转录酶4.0
英文名称:
Histan IV Reverse Transcriptase
产品规格:
10kU|50kU
发货周期:
1~3天
产品价格:
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Histan IV Reverse Transcriptase是通过基因工程技术得到的全新逆转录酶,热稳定性大幅度提高,可耐受60℃,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合低拷贝基因的逆转录和mRNA文库构建。Histan IV Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可扩增长达10kb的cDNA。广泛应用于全长cDNA文库构建;终点法PCR;实时定量PCR等领域。
保存:-20℃,有效期1年。
以Poly(A)·Oligo(dT)为模板-引物,在37℃,10min内,将1nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位。
一、第一链cDNA合成操作步骤
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组分 | 10kU | 50kU |
Histan IV Reverse Transcriptase(200U/μL) | 50μL | 250μL |
5×Histan IV Buffer | 250μL | 1.2mL |
保存:-20℃,有效期1年。
以Poly(A)·Oligo(dT)为模板-引物,在37℃,10min内,将1nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位。
- 请保持实验区域洁净,操作时需穿戴干净的手套、口罩,实验所用耗材均需保证RNase free,以防止RNase污染;
- 所有操作均应在冰上进行,防止发生RNA降解;
- 为保证逆转录成功,建议使用高质量的RNA样本;
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
- 本产品仅作科研用途!
一、第一链cDNA合成操作步骤
- RNA变性
此步为可选步骤,RNA变性有助于打开二级结构,可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。- 按下表加入各成分配制RNA变性反应体系
成分 用量 引物 Oligo (dT)18 (50μM) 1μL Random Primers (50μM) 1μL Gene Specific Primers(2μM) 1μL 模板RNA Total RNA 10pg~5μg mRNA 1pg~500ng RNase-free ddH2O 至13μL - 65℃加热5min,迅速置于冰上冷却2min。
- 简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液,并用移液器轻轻吹打混匀。
- 按下表加入各成分配制RNA变性反应体系
- 配制逆转录反应液
成分 用量 上一步的反应液 13μL 5×Histan IV Buffer 4μL dNTP Mix(10mM) 1μL Histan IV Reverse Transcriptase(200U/μL) 1μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL - 设置逆转录程序
温度 时间 25℃ 5min 50℃ 15min 85℃ 5min
注:- 当使用Random Primers时,需25℃,孵育5min;若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers,此步可省略;
- 逆转录温度:推荐使用50℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到55℃~60℃;
- 当使用Random Primers时,需25℃,孵育5min;若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers,此步可省略;
- 85℃加热5分钟,失活逆转录酶。
- 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应,也可-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。
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