产品货号：
RFT237
中文名称：
M-MLV反转录酶
英文名称：
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)
产品规格：
2000U
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
M-MLV反转录酶(RNase H-)，是一种经过改造和优化的反转录酶。和普通的M-MLV反转录酶相比，缺失了Ribonuclease H (RNase H)酶活性，不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，可以合成长片段从DNA。
M-MLV反转录酶(RNase H-)可以合成长达9～13kb的cDNA。该反转录酶的最适反应温度为42～45℃并且在55℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。
M-MLV反转录酶(RNase H-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
保存：-20℃
本产品中M-MLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl，用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。
50mM Tris，pH8.3，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，0.1% Triton X-100，50% glycerol。
该反转录酶(RNase H-)由大肠杆菌表达。
一个单位是指37℃条件下10分钟内将1nmol dTMP掺入多聚核苷酸所需的酶量。
活性检测条件：
50mM Tris-HCl (pH8.3)，6mM MgCl2，10mM DTT，40mM KCl，0.5mM dTTP，0.4MBq/ml [3H]-dTTP，0.4mM polyA·oligo(dT)12-18。
不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
70℃孵育10分钟可以导致M-MLV反转录酶(RNase H-)失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对该反转录酶(RNase H-)有抑制作用。
一、cDNA第一链合成
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M-MLV反转录酶(RNase H-)可以合成长达9～13kb的cDNA。该反转录酶的最适反应温度为42～45℃并且在55℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。
M-MLV反转录酶(RNase H-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
| 组分 | 规格 |
| M-MLV反转录酶（RNase H-,200U/μl） | 10μL |
| 5×RT buffer | 200μL |
保存：-20℃
本产品中M-MLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl，用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。
50mM Tris，pH8.3，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，0.1% Triton X-100，50% glycerol。
该反转录酶(RNase H-)由大肠杆菌表达。
一个单位是指37℃条件下10分钟内将1nmol dTMP掺入多聚核苷酸所需的酶量。
活性检测条件：
50mM Tris-HCl (pH8.3)，6mM MgCl2，10mM DTT，40mM KCl，0.5mM dTTP，0.4MBq/ml [3H]-dTTP，0.4mM polyA·oligo(dT)12-18。
不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
70℃孵育10分钟可以导致M-MLV反转录酶(RNase H-)失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对该反转录酶(RNase H-)有抑制作用。
一、cDNA第一链合成
- 0.2mL PCR管中配制模板/引物变性混合液：
加样顺序 成分 用量 1 模板RNA 1ng～1μg* 2 Oligo(dT)18primer(100μM)
或Random primer(100μM)
或Specific primer(10μM)0.5μL 3 RNase-free水 Up to 6μL
注*：Total RNA的使用量一般为1ng～1μg；mRNA的使用量一般为10pg～1μg。 - 70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
注：此步骤是打开RNA的一些比较稳定的二级结构。 - 离心数秒钟使模板RNA/引物的变性混合液聚集于离心管底部。
- 在上述离心管中配制下列反转录反应液。
加样顺序 成分 用量 1 模板/引物变性混合液 6μL 2 5×RT buffer 2μL 3 10mM dNTP 0.5μL 4（可选） RNase Inhibitor(40U/μl) 0.25μL 5 M-MLV(RNase H-) 0.25～1μL* 6 RNase-free水 up to 10μL
注*：当起始模板RNA量＞500ng时，M-MLV（RNase H-）的使用量应＞0.25μL。 - 若使用Oligo(dT)18或基因特异性引物，42℃温育30min；若使用随机引物，先30℃温育5min，之后42℃温育30min；
- 70℃保温10分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增，PCR扩增时cDNA溶液的推荐使用量50μL体系加2μL。
注：cDNA溶液置于-20℃可保存半年；置于-80℃可长期储存。
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