产品货号：
JN5141
中文名称：
单链DNA/RNA环化酶II
英文名称：
ssDNA/ssRNA Circleligase II
产品规格：
10T|50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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简要说明：
产品特点：
产品用途：
产品组成：
保存：-20℃，有效期1年。
活性定义：
注意事项：
使用方法：
常见问题：
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Circleligase II是高耐热型单链核酸连接酶，与传统T4 RNA连接酶1/2存在明显差异，反应过程不依赖于ATP供能。该酶可特异性识别携带5'-磷酸基团、3'-羟基末端的单链DNA（ssDNA）与单链RNA（ssRNA），在无互补模板、无双链支架的条件下催化单链核酸分子发生自环化；同时具备分子间连接活性，可介导单链核酸与5'磷酸化/5'腺苷酸化修饰的单链接头连接。本品热稳定性优异，最适反应温度60℃，高温反应可有效消除单链核酸自身形成的发夹、茎环、局部双链等二级结构，显著提升高GC、长片段单链底物的环化效率，广泛适配滚环扩增、液体活检测序等高通量分子生物学实验。
产品特点：
- 耐高温：最适60℃反应，消解核酸二级结构，适配15～200nt ssDNA/ssRNA高效自环。
- 双连接活性：支持单链自环化，亦可连接5'磷酸/腺苷酸化单链接头。
- 无需ATP：减少线性多聚体副产物，环状产物纯度更高。
- 高纯无杂酶：无DNase/RNase/磷酸酶及宿主DNA污染。
产品用途：
- 环状核酸模板制备：用于RCA滚环扩增、RCT滚环转录、环状探针合成。
- 液体活检测序：cfDNA/ctDNA建库、游离DNA甲基化测序。
- 小分子RNA测序：miRNA、lncRNA等短RNA文库环化。
- 接头连接建库：5'腺苷酸化接头连接，多重文库标记。
- 合成生物学应用：DNA纳米结构、核酸酶抗性标准品制备。
产品组成：
| 组分 | 10T | 50T |
| Circleligase II (100U/μL) | 10μL | 50μL |
| 5×Circleligase II Reaction Buffer | 100μL | 500μL |
| 50mM MnCl2 | 20μL | 100μL |
| ssDNA Control Oligo（5pmol/μL） | 5μL | 5μL |
| RNase-free water | 500μL | 1mL×2 |
保存：-20℃，有效期1年。
活性定义：
在60℃条件下，1小时内催化1pmol的标准线性单链寡核苷酸（70nt，5'磷酸化）转换成抗核酸外切酶I消化的环状结构所需要的酶量定义为1个活性单位。
注意事项：
- 本品仅适用于实验室科学研究，不可用于人体临床诊断。
- 实验全程佩戴一次性手套、口罩，避免酶液直接接触皮肤、黏膜。
- 含核酸染料的变性PAGE凝胶属于有害实验废弃物，需按照实验室生物安全规范统一处理。
- 使用后的废弃酶液、核酸反应产物，经高温彻底灭活后再丢弃。
使用方法：
- 常用反应体系
配制全程冰上操作，所有组分混匀后最后加入酶启动反应。成分 用量 5×Circleligase II Reaction Buffer 4μL 50mM MnCl2 1μL 5'-磷酸化ssDNA 1～10pmol RNase-free water 至20μL Circleligase II (100U/μL) 1μL - 底物硬性要求：核酸末端必须同时具备5'-磷酸基团与3'-羟基基团；无5'磷酸修饰的底物，需提前使用T4 PNK多核苷酸激酶完成末端磷酸化。
- 反应时长调整：常规短片段可60℃孵育30min完成环化；cfDNA、长片段、高GC复杂模板建议延长孵育至90～120min，或适当提升酶添加量。
- 抑制物规避：反应体系避免高浓度EDTA、高盐、酚、酒精残留，上述物质会显著抑制酶催化活性。
- 添加终浓度1M的甜菜碱，适用于高GC、易形成发夹结构的核酸。
- 底物硬性要求：核酸末端必须同时具备5'-磷酸基团与3'-羟基基团；无5'磷酸修饰的底物，需提前使用T4 PNK多核苷酸激酶完成末端磷酸化。
- 反应程序
- 环化反应：1×缓冲液体系下，60℃孵育60min（标准反应时长）。
- 热灭活终止：80℃恒温10min，彻底灭活Circleligase II。
- 后续可选操作：
- 直接加入Exo I消化去除未环化线性底物。
- 乙醇沉淀、磁珠纯化回收环状核酸。
- 直接用于滚环扩增、测序建库等下游实验。
- 直接加入Exo I消化去除未环化线性底物。
- 环化反应：1×缓冲液体系下，60℃孵育60min（标准反应时长）。
- 环化产物检测方法
- 方法1：20%变性尿素PAGE胶电泳检测
胶体系：20%聚丙烯酰胺凝胶+ 8M尿素变性体系。
检测原理：同等长度核酸分子，线性ssDNA电泳迁移速度快于环状ssDNA，环状产物条带位置更靠上。
染色成像：SYBR Gold或EB染色后紫外成像观察条带。
电泳图谱解读（70nt线性单链DNA实验图）。
图示.70nt线性单链DNA实验图
Lane1：未使用Circleligase II、未经过Exo I处理的70nt线性单链DNA，仅单一线性条带；
Lane2：Circleligase II处理后的70nt单链DNA环化产物，上方出现滞后环状条带，下方可见少量未环化线性底物条带；
Lane3：环化产物经Exo I酶切处理，下方线性底物条带完全消失，仅保留抗酶切环状条带，证明环化反应成功。 - 方法2：核酸外切酶I（Exo I）消化验证（金标准功能鉴定）
消化体系：20μL环化产物中加入1μL Exonuclease I。
消化条件：37℃恒温反应45min，反应结束后80℃孵育15min灭活Exo I。
酶特异性说明：Exonuclease I仅可从ssDNA的3'-OH末端逐步降解线性单链DNA，水解产物为5'-单核苷酸；无游离末端的环状单链DNA不会被降解，同时该酶不作用于双链DNA与各类RNA。
结果判定标准：消化后电泳无线性核酸条带，仅存在滞后环状条带，代表环化效率良好。若底物含大量发夹二级结构，可使用Exo I + Exo III双酶共同消化，去除线性双链中间体。
- 方法1：20%变性尿素PAGE胶电泳检测
常见问题：
- 环化效率极低，电泳存在大量线性底物残留？
底物缺少5'磷酸修饰，需提前使用T4 PNK进行磷酸化处理。
核酸底物投入浓度过高，稀释底物至0.1～5pmol/20μL体系。 - 电泳出现大量高分子量多聚体杂带？
核酸底物投入浓度过高，降低体系内核酸总量；缩短反应孵育时间，减少分子间连接副反应。 - Exo I消化后环状产物条带亮度微弱？
环化反应不完全，可延长孵育时间或微调反应温度至62℃；检查5×缓冲液是否过期失效。 - 本品是否可用于双链DNA环化？
本品仅催化单链DNA、单链RNA发生环化/连接，双链DNA环化实验需选用T4 DNA连接酶。 - 反应体系中能否额外添加ATP？
常规环化反应无需添加ATP，外源ATP易生成线性多聚体；仅高二级结构难环化底物可微量添加至终浓度0.05mM，高浓度ATP（＞1mM）会强烈抑制酶活。
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