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本制品能在RNA 5'末端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O上添加甲基基团，利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，使带帽Cap 0甲基化为Cap 1。该酶只能以带7-甲基鸟苷帽结构（m⁷GpppN）的RNA为底物，不会作用于5'末端为pN、ppN、pppN或GpppN的RNA。带7-甲基鸟苷帽结构（m⁷GpppN）的RNA可通过我司的mRNA加帽试剂盒(Cap0结构，货号：JN3055)获得。

Cap 0-和Cap 1-mRNA之间的差异在RNA 5'端第一位核苷酸（N₁）是否具有2'-O-甲基，在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1结构提高了mRNA的翻译效率。


图1.mRNA帽结构2' -O-甲基转移酶作用机理。mRNA的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5'–5'三磷酸酯桥连接到mRNA链的5'核苷上组成。Cap0结构由相邻的RNA链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2'-O-甲基转移酶的参与，该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。


纯化自携带牛痘病毒mRNA帽结构2' -O-甲基转移酶基因的E.coli菌株。

单位定义
1单位是指在37℃的条件下，1小时内将10pmol 80nt的带帽RNA转录子甲基化所需酶量。

组分	规格
Cap0-mRNA 2'-O-Methyltransferase(50U/μL)	50μL
10×Capping Buffer	100μL
SAM(32mM)	10μL
RNase-Free Water	1mL

保存：-20℃，避免反复冻融。

反应条件
1×Capping Buffer，在37℃孵育。


1×Capping Buffer：
50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM KCl，1mM MgCl₂，1mM DTT。


无大肠杆菌DNA残留、无核酸内、外切酶残留及RNA酶残留。

• SAM：需事先计算好SAM的用量，在反应开始前把分装的32mM的储备液稀释成2mM的工作液。SAM在pH7～8，37℃条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免SAM降解，该工作液需要保存于冰上。
  
• Cap 0-RNA的制备：IVT RNA需进行纯化并溶解于RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA溶液或其他盐溶液中。Cap 0-RNA可通过百奥莱博的mRNA加帽试剂盒(Cap0结构，货号：JN3055)反应体系获得。为减少反应步骤，也可通过在同一体系内添加两种酶直接获得Cap1-RNA，该反应基于百奥莱博的mRNA加帽试剂盒(Cap1结构，货号：JN3056)，试剂盒内涵盖了Cap0结构加帽系统和2'-O-甲基转移酶。
  
• RNA二级结构：一些RNA转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热RNA可以去除转录产物5'端的二级结构，如果转录产物的5'端结构复杂，可以把加热时间延长至10min。
  
• Poly(A)尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用白鸟莱博的E.coli Poly(A) Polymerase（货号：JN3052）进行加尾。加帽和加尾后的RNA需在进行RNA转染实验前做纯化处理。
  
• RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入0.5μL百奥莱博的RNase抑制剂（货号：JN0013），同时去掉等体积的RNasefree水。

本步骤适用于10μg以内Cap 0-RNA（≥100nt）的Cap1反应，且可根据实验需要放大。

• 用RNase-free water将适量Capped RNA稀释至16μL；
  
• 将RNA置于65℃加热5min，结束后冰上放置5min；
  
• 将32mM SAM稀释至4mM；
  
• 依次加入以下各组分：
  

  成分	用量
  Denatured Capped RNA	16μL
  10×Capping Buffer	2μL
  SAM(4mM)	1μL
  Cap0-mRNA 2'-O-Methyltransferase(50U/μL)	1μL

  
  
• 37℃反应60min（对于长度小于200nt的RNA，将孵育时间延长至2小时）。
  
• 此时获得的Cap 1-RNA可直接进行3’端Poly(A)尾的添加，此反应可通过百奥莱博的E.coli Poly(A) Polymerase（货号：货号：JN3052）完成。

• 加帽效率低有哪些原因及解决方法？
  
  • 在加帽反应之前，应将IVT产生的RNA纯化去除残留蛋白质，污染物和未结合核苷酸，并溶解在RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA或其他盐溶液中；
    
  • SAM在室温下会慢慢降解，需始终放置在冰上，由于SAM的降解导致的N7甲基化效率低，会进一步导致加帽失败；
    
  • 可以适当增加RNA热变性的条件，把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min；
    
  • 某些RNA会在5'末端形成稳定结构（如同源二聚体，发卡结构），限制加帽酶靠近。分析序列后可以将RNA变性温度增加。如5'末端高度结构化，需要通过分子生物学技术来修改序列。通常可以通过在转录RNA（非编码区）的DNA模板前5个碱基中进行单点突变来实现。
• 缓冲液出现白色沉淀如何解决？
  
  • 将反应缓冲液在37℃孵育5min，彻底混匀以溶解沉淀物；
    
  • 不要将试剂盒储存于-70℃。

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