产品货号：
BM1002
中文名称：
T4 DNA快速连接酶
英文名称：
T4 DNA Fast Ligase
产品规格：
1000U
发货周期：
1～3天
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本制品由携带T4噬菌体gene 30的大肠杆菌产生。该酶催化双螺旋DNA或RNA之间的5'-磷酸基团和3'-羟基之间形成磷酸二酯键。该酶在双链DNA、RNA或者DNA/RNA复合物间可修复单链缺刻，并且可以连接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但对于单链核酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物DNA片段克隆、基因定点突变与PCR产物克隆、线性DNA自环化与修复双链DNA缺刻。T4 DNA快速连接酶需要ATP作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接反应仅需10分钟。
37℃条件下，1 Weiss unit的酶在20min内催化1nmol的[32PPi]转变为活性炭吸附态。1 Weiss unit等同于约200个粘性末端连接反应单位（CEU），相当于在16℃条件下，30min内连接50% HindIII消化后的λDNA片段。
酶活检测条件：66mM Tris-HCl (pH7.6)，6.6mM MgCl2，66μM ATP，10mM DTT，3.3μM [32PPi]。
| 组分 | 规格 |
| T4 DNA快速连接酶(5U/μL) | 200μL |
| 10×T4 DNA Ligase Buffer | 1mL |
| 50% PEG | 1mL |
保存：-20℃
- 核酸内切酶残留检测：37℃条件下，将200U的T4 DNA快速连接酶与1μg的pUC19 DNA中温育4h，未检测出由共价闭合环状DNA转变为带有缺刻的DNA。
- 核酸外切酶残留检测：将酶液与双链DNA底物在37℃温育16h，通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化。
- 蓝白斑测试：室温条件下，使用30U T4 DNA Ligase(Fast)连接pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化产物1h，然后用E.coli XL1-Blue感受态细胞转化连接产物，检测到少于1%的白斑。
- T4 DNA Ligase(Fast)在浓度高于200mM的NaCl或KCl中会被强烈抑制；
- 连接反应液添加量不应该超过感受态细胞体积的10%，不推荐体系中加入过量的T4 DNA Ligase(Fast)；
- 与T4 DNA Ligase(Fast)结合的DNA可能会在琼脂糖凝胶中出现带移或弥散，为了避免此现象，可以在上样前对酶进行热失活，必要时加入适量的SDS；
- 聚乙二醇(PEG)能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG 8000的推荐添加量是连接体系的5% (w/v)；
- 电转化效率可能通过对T4 DNA Ligase(Fast)热失活或者使用离心柱或者氯仿抽提纯化DNA方式来提高；
- 转化子数目可通过延长反应时间至1h而增加。
- DNA插入片段连接至载体DNA（粘性末端连接）
- 于冰上配制如下反应体系：
成分 用量 线性化载体DNA 20～100ng 插入片段DNA 3:1~10:1 (片段：载体摩尔比) 10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL T4 DNA快速连接酶(5U/μL) 1U (0.2μL) 无核酸酶水 至20μL - 充分混匀并瞬离，22℃温育10min；
- 取1～5μL的连接产物用于50μL化学感受态细胞的转化，或者取1～2μL用于50μL电转感受态细胞的转化。
- 如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
- 于冰上配制如下反应体系：
- DNA插入片段连接至载体DNA（平末端连接）
- 于冰上配制如下反应体系：
成分 用量 线性化载体DNA 20～100ng 插入片段DNA 3:1~10:1 (片段：载体摩尔比) 10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL 50% PEG 2μL T4 DNA快速连接酶(5U/μL) 5U (1μL) 无核酸酶水 至20μL - 充分混匀并瞬离，22℃温育1h；
- 取1～5μL的连接产物用于50μL化学感受态细胞的转化，或者取1～2μL用于50μL电转感受态细胞的转化。
- 如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
- 于冰上配制如下反应体系：
- 线性DNA自环化
- 于冰上配制如下反应体系：
成分 用量 线性化DNA 10～50ng 10×T4 DNA Ligase Buffer 5μL T4 DNA快速连接酶(5U/μL) 5U (1μL) 无核酸酶水 至50μL - 彻底混匀并瞬离，22℃温育10min；
- 取1～5μL的连接产物用于50μL化学感受态细胞的转化，或者取1～2μL用于50μL电转感受态细胞的转化。
- 如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
- 于冰上配制如下反应体系：
- 接头连接
双链寡核苷酸接头经常被用于在插入片段上产生粘性末端。接头通常包含限制酶识别位点，在连接后经酶切处理产生和克隆载体匹配的粘端。有时候接头已包含与克隆载体匹配的粘端，此时无需在接头连接完成后进行插入片段的进一步处理。- 于冰上配制如下反应体系：
成分 用量 线性化DNA 100～500ng 磷酸化接头 1～2μg 10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL 50% PEG 2μL T4 DNA快速连接酶(5U/μL) 2U (0.4μL) 无核酸酶水 至20μL - 彻底混匀并瞬离，22℃温育10min；
- 在65℃作用10min或者70℃作用5min，进行热失活。
- 添加1mM ATP的条件下，T4 DNA快速连接酶在CutFlash酶切缓冲液中具有100%的活力。因此，接头连接反应时可以在CutFlash酶切缓冲液中进行，以简化“接头连接-酶切”实验流程。具体方法为：向接头连接体系中添加ATP至终浓度1mM，接头连接反应完成后，先失活T4 DNA Ligase(Fast)。然后，再在体系中加入适量的LightFlash快速内切酶，最后使用最适酶切反应温度进行温育即可。
- CutFlash酶切缓冲液中不含ATP组分，百奥莱博为您提供独立包装的100mM ATP母液，敬请选购！
- 添加1mM ATP的条件下，T4 DNA快速连接酶在CutFlash酶切缓冲液中具有100%的活力。因此，接头连接反应时可以在CutFlash酶切缓冲液中进行，以简化“接头连接-酶切”实验流程。具体方法为：向接头连接体系中添加ATP至终浓度1mM，接头连接反应完成后，先失活T4 DNA Ligase(Fast)。然后，再在体系中加入适量的LightFlash快速内切酶，最后使用最适酶切反应温度进行温育即可。
- 于冰上配制如下反应体系：
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