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本制品是以DiD为荧光探针，并提供了染色增强剂和染色缓冲液，可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官细胞膜染色的试剂盒。仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞膜远红荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。本试剂盒提供了染色增强剂，使细胞膜染色更加快速，荧光染色更加明亮，染色背景更低。

DiD染色后可以兼容免疫荧光实验。建议使用免疫染色通透液或使用洋地黄皂苷配制的不会溶解细胞膜的通透液进行通透，其它去垢剂配制的通透液可能会溶解细胞膜上的脂类物质，造成DiD失去结合位置，最终导致DiD的染色失效。但通透也可能会影响DiD在细胞膜上的定位并会增加细胞内的染色，具体实验中需根据实验的需求选择合适的细胞通透液。

本试剂盒可以直接染色活的细胞或组织，染色时间通常为15分钟。对于固定的细胞或组织，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。

• 适用范围广：本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
  
• 使用便捷：整个检测过程仅需约15～30分钟即可完成。对于常规的3D细胞活细胞染色，仅需将本试剂盒中的By3D DiD (200×)和染色增强剂(400×)按照相应比例用染色缓冲液配制成By3D DiD染色工作液，避光孵育15分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照或者荧光酶标仪定量等荧光检测和分析。也可以固定后再使用本制品进行染色。

传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反应细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。

DiD是DiI的类似物，但具有更长的激发和发射波长，为远红荧光，在一些细胞和组织染色中更有优势，特别适合用于进行多种荧光的同时染色。DiD是一种亲脂性羰花青染料，具有很长的亲脂性烃链，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色，染色后非常稳定。DiD可被633nm的氦-氖(He-Ne)激光所激发，DiD在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiD被激发后可以发出远红的荧光，最大激发波长为644nm，最大发射波长为665nm。DiD被广泛用于正向或逆向的、活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂。DiD毒性很低，通常不会影响细胞的生存力。

• 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，固定、PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  
• 如果染色时间过长或染色后细胞继续培养，探针也可能进入细胞内而染色其它细胞器的膜。
  
• 染色缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果染色缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
  
• 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

• 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。
  
  • 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间等可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行染色效果较好。
• 3D细胞固定(选做)：小心去除孔内培养液，每孔加入100μL免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定液，室温固定细胞10分钟。
  
  • 为达到最佳的使用效果，具体的固定时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状体大小等进行调整。
  • 固定细胞球等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
• 3D细胞DiD染色：
  
  • By3D DiD染色工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D DiD染色工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
    
  • By3D DiD染色工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D DiD染色工作液的量，用染色缓冲液稀释配制适量的By3D DiD染色工作液。
    

    样品数	10个样品	50个样品	100个样品
    By3D DiD (200×)	5μL	25μL	50μL
    染色增强剂(400×)	2.5μL	12.5μL	25μL
    染色缓冲液	992.5μL	4.962mL	9.925mL
    By3D DiD染色工作液	1mL	5mL	10mL

    • 配制好的By3D DiD染色工作液必须一次使用完毕，不能冻存。
    • By3D DiD染色工作液中的DiD的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。DiD的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。DiD的最终浓度改变时，染色增强剂的用量可以不变。
  • 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D DiD染色工作液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育15分钟。
    
    • 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
• 荧光检测：
  
  • 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
    
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  • 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(DiD为红色荧光，Ex/Em=644/665nm)。
    
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。