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简要说明：

本制品是一种快速、高效、便捷的基于绿色荧光探针BalbAIE Nuclear Green Probe特异地对坏死细胞的细胞核进行染色的试剂盒。本试剂盒可使用含有相关检测通道的荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。

BalbAIE Nuclear Green Probe是一种新型的非细胞膜通透性的细胞核荧光探针，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，但可穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋，从而产生明亮的绿色荧光。因此，BalbAIE Nuclear Green Probe仅能对死细胞或固定并通透后细胞的染色，从而被用来区分正常细胞与坏死细胞。本探针是一种基于聚集诱导发光荧光材料的三苯氨基衍生物，具有典型的聚集诱导发光效应特性。

本试剂盒内提供的BalbAIE Nuclear Green Probe(1000×)为储存液，推荐BalbAIE Nuclear Green Probe的使用浓度为1×，孵育时间为10～30分钟。为了达到良好的染色效果，建议根据自身实验条件和细胞或组织摸索BalbAIE Nuclear Green Probe的使用浓度与染色时间。

光谱特性：
BalbAIE Nuclear Green Probe在进入细胞之前荧光信号非常弱，在进入细胞并与细胞核DNA双螺旋结合前后由于聚集状态的变化其荧光强度会产生极为明显的变化。BalbAIE Nuclear Green Probe被激发后可以发出绿色的荧光，与DNA结合后的激发光谱和发射光谱参考图1。其中，最大激发波长为455nm，最大发射波长为551nm。

图1.BalbAIE Nuclear Green Probe和DNA结合后的激发光谱与发射光谱。

产品组成：

组分	规格
BalbAIE Nuclear Green Probe(1000×)	10μL
Assay Buffer	10mL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

注意事项：

• 与传统染料不同，AIE染料“斯托克斯”位移较大，可能不适配部分常规荧光显微镜的成像通道，通常建议使用共聚焦显微镜或流式细胞仪进行检测。
  
• 由于组织样品的特殊性，其固定、通透及探针浓度等条件需要进行一定的优化。
  
• 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用黑色96孔板或黑色透明底96孔细胞培养板。
  
• Assay Buffer经过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
  
• BalbAIE Nuclear Green Probe(1000×)为荧光染料，收到时可以根据需要适当进行分装，避免反复冻融，操作时请注意避光。
  
• 如需使用HBSS，推荐选购Hanks' Balanced Salt Solution。

使用方法：

• BalbAIE Staining Solution的配制：
  96孔板每孔所需BalbAIE Staining Solution的量为100μL，其它培养器皿的BalbAIE Staining Solution的用量以此类推；对于细胞悬液每50～100万细胞需0.5mL BalbAIE Staining Solution。取适量BalbAIE Nuclear Green Probe(1000×)，按照每1μL BalbAIE Nuclear Green Probe(1000×)加入1mL Assay Buffer的比例稀释BalbAIE Nuclear Green Probe，混匀后即为BalbAIE Staining Solution。
  
  • 配制BalbAIE Staining Solution时注意避光，且须现配现用，稀释后不能长期保存。
    
  • 为获得理想的检测效果，BalbAIE Staining Solution中BalbAIE Nuclear Green Probe的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化，例如用于流式细胞仪检测时推荐浓度为0.5×。
    
  • 本试剂盒中提供的Assay Buffer可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养。
    
  • 如果用于坏死细胞的细胞核染色，可直接使用BalbAIE Staining Solution进行染色；如果用于非坏死细胞的细胞核染色，则需要固定、通透并使用RNase A (货号：YT005/YT006/YT007/YT008)处理后再进行染色，推荐直接使用细胞核绿色荧光染色试剂盒。
• 对于悬浮细胞：
  
  • 细胞按照实验设计进行一定处理后，酌情取约10～100万细胞600×g室温离心5分钟，弃上清，加入适当体积的BalbAIE Staining Solution重悬细胞，使细胞密度为100～1000万/mL。
    
  • 细胞培养箱中37℃孵育10～30分钟，不同的细胞最佳孵育时间不同。以10分钟作为初始孵育时间，根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
    
  • 500～1000×g室温离心5分钟。
    
  • 吸除上清液，再次缓慢加入37℃预热的细胞培养液重悬细胞。
    
  • 流式细胞仪检测，或将细胞转移至多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上，在荧光显微镜下观察。BalbAIE Nuclear Green Probe为绿色荧光，最大激发光波长为455nm，最大发射光波长为551nm。推荐使用流式细胞仪BV510 (Ex/Em=405/525nm)通道进行检测，也可以使用FITC (Ex/Em=488/525nm)通道进行检测，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
    
    • BV510通道也称为KO525、Krome Orange、AmCyan、V500等通道。
• 对于贴壁细胞：
  
  对于贴壁细胞，如果希望采用流式细胞仪检测，可以先消化并收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
  
  本步骤以96孔板为例进行描述，其它孔板检测试剂的用量参考96孔板的用量进行适当调整。
  
  • 吸除细胞培养液，用无血清的细胞培养液或PBS洗涤细胞2次。
    
  • 每孔加入100μL BalbAIE Staining Solution，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
    
  • 37℃避光孵育10～30分钟。不同的细胞最佳孵育时间不同，根据实际所用的细胞优化染色孵育时间，以得到最佳的荧光染色效果。
    
  • 吸除上清，加入100μL完全培养液即可在荧光显微镜下观察。BalbAIE Nuclear Green Probe为绿色荧光，最大激发光波长为455nm，最大发射光波长为551nm。

使用效果：

图2.本试剂盒检测坏死的L-929细胞的荧光染色效果图。图A为部分坏死的L-929细胞在明场下的形态图；图B的绿色荧光为BalbAIE Nuclear Green Probe染色的部分坏死的L-929细胞的细胞核。L-929细胞经TSZ处理4小时即可发生明显的部分细胞坏死。TSZ是由TNFα、SM-164、Z-VAD-FMK组成的细胞程序性坏死诱导试剂盒。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图3.本试剂盒检测坏死的L-929细胞的流式细胞仪检测效果图。L-929细胞经TSZ处理4小时即可发生明显的坏死，使用本试剂盒进行荧光染色后经流式细胞仪检测可以明显区分死细胞和活细胞。流式细胞仪检测通道为BV510 (Ex/Em=405/525nm)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
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