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本制品是一种快速、高效、便捷的基于BalbAIE Nuclear Green Probe特异地对死细胞或固定后的细胞或组织样品的细胞核进行染色的试剂盒。本试剂盒可使用含有相关检测通道的荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。本试剂盒中含有RNase A，能有效消除BalbAIE Nuclear Green Probe对于样品中RNA的染色，使细胞核染色效果更好。

BalbAIE Nuclear Green Probe，是一种新型的非细胞膜通透性的细胞核荧光探针，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，但可穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋，从而产生明亮的绿色荧光。因此，BalbAIE Nuclear Green Probe仅对死细胞或经通透处理的固定后的细胞染色，从而能用于区分正常细胞与坏死细胞。BalbAIE Nuclear Green Probe对具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞的细胞核染色时需固定并通透处理，然后才能染色。由于BalbAIE Nuclear Green Probe结合DNA的同时也可以结合RNA，因此对细胞核染色时，还需要酌情使用RNase A等先去除RNA，使BalbAIE Nuclear Green Probe仅对DNA染色，从而用于细胞核的荧光染色。

BalbAIE Nuclear Green Probe是一种基于聚集诱导发光荧光材料的三苯氨基衍生物，具有典型的聚集诱导发光效应特性。本探针在进入细胞之前荧光信号非常弱，在进入细胞并与细胞核DNA双螺旋结合前后由于聚集状态的变化其荧光强度会产生极为明显的变化。BalbAIE Nuclear Green Probe被激发后可以发出绿色的荧光，与DNA结合后的最大激发波长为455nm，最大发射波长为551nm。

• 与传统染料不同，AIE染料“斯托克斯”位移较大，可能不适配部分常规荧光显微镜的成像通道，通常建议使用共聚焦显微镜或流式细胞仪进行检测。
  
• 由于组织样品的特殊性，其固定、通透及探针浓度等条件需要进行一定的优化。
  
• 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用黑色96孔细胞培养板或黑色透明底96孔细胞培养板。
  
• Assay Buffer经过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
  
• BalbAIE Nuclear Green Probe (1000×)为荧光染料，首次使用时可以根据需要适当进行分装，尽量避免反复冻融，操作时请注意避光。

• BalbAIE Staining Solution的配制：
  
  • BalbAIE Staining Solution的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔的BalbAIE Staining Solution分别为1mL、0.5mL、250μL和100μL；对于悬浮细胞样品，每100万个细胞样品的BalbAIE Staining Solution为100μL；对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100～200μL。
    
  • BalbAIE Staining Solution的配制：根据样品数量和每个样品所需工作液的体积，计算出BalbAIE Staining Solution的总体积。以荧光显微镜检测96孔板为例，每个孔的用量为100μL，参照下表进行配制。
    

    样品数	1	10	100
    BalbAIE Nuclear Green Probe (1000×)	0.1μL	1μL	10μL
    RNase A (50×)	2μL	20μL	200μL
    Assay Buffer	100μL	1mL	10mL
    BalbAIE Staining Solution	~100μL	~1mL	~10mL

    • 不同细胞的最佳染色浓度略有不同，BalbAIE Nuclear Green Probe的最终浓度建议根据不同细胞系和实验体系进行优化，可在0.5～2×之间进行调整。BalbAIE Nuclear Green Probe的最终浓度提高时，RNase A (50×)的用量不变。
    • RNase A处理为可选。如果需要消除BalbAIE Nuclear Green Probe对于样品中RNA的染色，则加入RNase A。
• 固定后细胞或切片的染色：
  
  • 固定和通透(选做)：如果希望所有细胞的细胞核都进行染色，须执行本步骤；如果仅希望染色死细胞请忽略本步骤。
    
    • 使用PBS清洗细胞/切片1～2遍，每次1分钟。
      
    • 使用4%多聚甲醛固定液或免疫染色固定液对细胞进行固定，室温固定10～15分钟。
      
    • 吸除固定液，用PBS或免疫染色洗涤液洗涤细胞2～3遍，每次1～3分钟。
      
    • 使用免疫染色通透液或配制在PBS中的0.5% 曲拉通X-100进行通透，室温5分钟。然后用PBS或免疫染色洗涤液洗涤细胞2～3遍，每次1～3分钟。
      
      • 使用免疫染色洗涤液的情况下，无须再进行通透处理，因为免疫染色洗涤液具有通透细胞膜的能力。
    • 随后如果需要进行免疫荧光染色，按照免疫荧光染色的方法先进行抗体的孵育或用其它染料进行染色。免疫荧光染色完毕后再按步骤B2开始进行固定、通透即后续的细胞核染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行细胞核染色。
  • 染色：
    
    • 对于贴壁细胞或组织切片，加入适当体积的BalbAIE Staining Solution，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞或样品。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的BalbAIE Staining Solution，混匀。
      
    • 室温避光孵育15～30分钟，以20分钟为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。
      
    • 对于贴壁细胞或组织切片，吸除BalbAIE Staining Solution，用PBS或免疫染色洗涤液洗涤2～3次，每次1～3分钟。对于悬浮细胞，1000×g离心5分钟，小心吸除上清液，缓慢加入PBS重悬细胞。重复前述的离心、去除上清和PBS重悬的洗涤步骤2次，将细胞滴加至孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上。
      
    • 直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。BalbAIE Nuclear Green Probe为绿色荧光，最大激发光波长为455nm，最大发射光波长为551nm。

聚集诱导发光(AIE)是由中国科学院院士唐本忠教授于2001年提出的原创性新科学概念。具有AIE效应的材料，在分散态下发光微弱甚至不发光，聚集后发光显著增强，呈现出颠覆传统认知的光物理现象。目前AIE已成为生物学、医学、化学、材料等领域的研究热点，多次入选全球热点前沿研究领域。AIE系列荧光探针有如下特点。

• 聚集诱导发光。AIE荧光探针在溶液及细胞环境中能保持微弱的荧光信号，而进入细胞并与目标结构结合聚集后，其荧光信号会大幅度增强，因此在成像过程中可以忽略溶液及细胞中未与特定结构结合的荧光分子，从而在染色后通常可以直接进行成像，无需多次洗涤，可以显著简化成像流程。
  
• 较大的斯托克斯(Stokes)位移。AIE荧光探针在荧光成像中能够极大程度地避免信号串扰和自淬灭现象，显著提高荧光成像清晰度，从而进一步提升成像精确度。
  
• 极佳的光学稳定性。AIE荧光探针能在长时间的细胞成像过程中维持稳定的荧光信号输出，特别适用于长期追踪、多次扫描的荧光成像实验。
  
• 抗淬灭能力强。与传统荧光探针相比，AIE荧光探针能有效规避浓度过高导致的荧光淬灭问题，在高浓度应用场景更有竞争力。