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碘化丙啶(PI)与DNA结合，它不具备序列选择性，每4～5个碱基对进行插入。PI也可以与RNA结合，因此在RNA核酸治疗中，需要区别PI是与DNA还是RNA结合，但PI一旦与核酸结合，其荧光增强20～30倍，荧光激发向红色最大光位移大约30～40nm，荧光发射向蓝光最大位移大约15nm。虽然其摩尔吸光系数比较低，但是PI具有一个足够打的斯托克斯位移(stokes shift)，可以通过合适的光学滤光器来检测到其标记的核DNA或者标记结合的抗体。PI适用于荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪以及荧光光度法。

PI不具备膜渗透性，通常用于多色荧光技术中区分死细胞群体。PI的复染操作，可以涉及到多种实验应用，如细胞学标记技术、直接或间接地抗体荧光检测、mRNA表达原位杂交以及特定的细胞结构荧光试剂染色。

1. 荧光显微镜贴壁细胞复染
   
   1. 样品准备：
      根据需要固定样本。PI染色通常与其他染色步骤同时操作。
      注意：做复染的样本都必须要做固定与促渗。
      
   2. RNA酶处理：
      固定于多聚甲醛、甲醛或戊二醛需要进行RNA酶处理，但如果样本用甲醇/乙酸或者丙酮固定，通常可以不必进行RNA酶处理。
      
      1. 2×SSC溶液(0.3M NaCl,0.03M sodium citrate,pH7.0)简单平衡样本。
         
      2. 用含100μg/mL的DNase-Free的RNase的2×SSC溶液中37℃处理20分钟。
         
      3. 2×SSC洗涤三次，每次一分钟。
   3. 复染操作
      
      1. 2×SSC溶液(0.3M NaCl,0.03M sodium citrate,pH7.0)简单平衡样本。
         
      2. 制备PI储液：蒸馏水溶解PI固体，浓度为1mg/mL，即1.5mM。
         
      3. 制备PI染色液与染色：2×SSC溶液1:3000稀释PI储液为500nM。准备一个反应300μL PI染色液。培养细胞孵育染色时间大约1～5分钟。
         
      4. 2×SSC多次洗涤样品，沥干多余缓冲液，抗淬灭剂封片。
         
      5. 选择合适的滤光器在荧光显微镜下观察。
   
   
   
2. 流式细胞仪悬浮细胞复染
   
   1. 样品准备：
      根据需要固定样本。PI染色通常与其他染色步骤同时操作。
      
      1. 收集细胞悬液调整数量至2×10⁵～1×10⁶ cells.
         
      2. 离心收集细胞弃上清液。
         
      3. 室温加入1mL PBS轻弹管壁，使之重悬。
         
      4. 将上述细胞悬液用移液器慢慢加入到4mL的无水乙醇后，最大转速涡旋混匀，将细胞放置于-20℃，5～15分钟。
         
      5. 离心收集细胞，去掉乙醇。
         
      6. 加入5mL PBS重悬细胞，室温放置15分钟，使得细胞重新吸收水分。
   2. 复染操作
      
      1. 制备PI储液：染色缓冲液(100mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,1mM CaCl₂,0.5mM MgCl₂,0.1% Nonidet P-40)溶解PI固体，浓度为1mg/mL，即1.5mM。每一个染色反应大约需要1mL的PI染色工作液
         
      2. 接上A.6.步骤，离心收集细胞，加入1mL PI染色工作液。室温孵育15分钟。直接上机分析。(如需进行荧光显微镜观察，细胞可以离心后去掉上清，以新鲜缓冲液重新悬浮细胞，吸取一滴悬浮液加到载玻片上，加盖玻片后观察。)
   
   
   
3. 染色质FISH复染
   
   1. 样品准备：
      根据需要处理样本，蒸馏水简单冲洗，去除缓冲液，最后的冲洗可以有助于减少非特异性背景，再晾干。
      
   2. 复染步骤：
      
      1. 制备PI储液：蒸馏水溶解PI固体，浓度为1mg/mL，即1.5mM。
         
      2. PBS以1:1000稀释DAPI储液。吸取300μL的染色液直接加到样品上，加盖玻片使染色液均匀分布于样本上。如有必要，加入新鲜配制的RNase A至终浓度10μg/mL，并加盖盖玻片使溶液分布均匀。
         
      3. 避光室温孵育30分钟(如有RNase A，选择37℃孵育)。
         
      4. 小心移去盖玻片，PBS或蒸馏水洗涤样本，去掉多余染料。
         
      5. 加盖玻片，用指甲油或中性树脂封片，或根据需要用抗淬灭试剂封片。
         
      6. 选取合适的滤光片观察样本。