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抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)作为破骨细胞的特异性标志酶，是鉴别破骨细胞的重要标志。通常情况下，TRAP可存在于人血液中的白细胞、骨髓和组织中。TRAP染色液的原理为：TRAP染色液是以萘酚AS-BI磷酸盐为底物，六偶氮副品红为显色剂，在酒石酸钾钠存在的酸性条件下，萘酚AS-BI磷酸盐被酸性磷酸酶水解释放出磷酸和萘酚，萘酚立即与六偶氮副品红偶联生成不溶性有色沉淀物，沉积于胞浆内，沉淀物的显色深浅与TRAP活性成正比。本染色液可用于石蜡切片、血液及骨髓涂片、细胞爬片的破骨细胞染色。

本试剂盒一次性配制40mL染色液，24孔板染色按300～500μL每孔，可以完成80～100个孔染色，切片每样本按100μL染色体积可以完成400张切片。

1. 试剂盒需要现配现用，且当天用完。
   
2. 使用的去离子水必须保证水温为37℃，以防固体析出。
   
3. 底物孵育时必须要避光。
   
4. 如果样本为骨片的石蜡切片，要注意不可用硝酸脱钙，会影响特异性酶染色，从而导致染色失败。
   
5. 该试剂盒所有应用液配制后立即使用，当天用完。

1. 试剂准备：
   
   1. 固定液配制：取50mL干净离心管，加入18mL去离子水后，分别加入固定液1和固定液2，混匀，2～8℃待用。
      
   2. 染色液A配制：取A粉完全溶于A液。
      
   3. 染色液B配制：取B粉完全溶于B液。
      
   4. TRAP染色工作液配制：提前准备33mL去离子水，温热至37℃后，分别加入上述制备的染色液A、染色液B、C粉和D液，完全溶解，配制成40mL TRAP染色工作液，棕色絮状物以滤纸过滤除去，现用现配。
2. 以Raw264.7细胞24孔板诱导破骨细胞为例，制备好的细胞样本，去除培养基，PBS洗涤去除血清残留，加入步骤1配制的固定液300～500μL，室温固定30s后，去除固定液，去离子水1mL洗涤一次。
   
3. 吸尽孔板内的去离子水，每孔加入5步骤配制的TRAP染色工作液300～500μL，避光，37℃孵育60min。
   
4. 取出孵育结束的孔板，去除染色液，去离子水1mL洗涤2次，每次3min。
   
5. 每孔加入复染液300～500μL，室温孵育5min后，去除复染液，去离子水1mL洗涤2次，每次3min。
   
6. 加入300μL甘油后，在光学显微镜下拍照镜检。