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F03细胞内钙离子染色试剂盒是利用F系列Ca²⁺钙离子荧光探针进行钙离子特异性染色的试剂盒。本试剂盒中的F03细胞内钙离子染色探针为绿色荧光标记的钙离子探针，具有505/525nm的最大激发/发射波长。

F03具有极高的细胞渗透性，经过简单孵育即可实现细胞加载。穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成不易透过细胞膜的F03新产物，从而被滞留在细胞内。F03游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至100倍，被激发后可以发出绿色的荧光，具有很高的淬灭常数和激发态寿命。最大激发波长为505nm，最大发射波长为525nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为515～530nm。可以使用荧光显微镜、酶标仪、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

F03荧光探针采用可见光激发，与传统的紫外光激发的荧光探针相比，仪器的适用范围更广泛，具有更强的探针吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca²⁺变化，从而降低了对活细胞的光毒性，检测敏感度更高。

• 螺旋盖微量试剂管装试剂开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• F03染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 用前，将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 染色后立即进行分析。
  
• 本染色液可用于细胞涂片、细胞的检测。
  
• F03探针在水中的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
  
• F03探针对湿度比较敏感，每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密闭保存。不可使用含水的吸头。
  
• 试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
  
• 可在染色溶液中加入等体积的20% Pluronic F127溶液(可选步骤),Pluronic F127可以帮助F03更快进入细胞，不建议在Pluronic F127中长期保存F03溶液。
  
• 标记条件因细胞的种类而异，据不同样本实际染色结果做相应调整，每次正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。以下方法仅供参考。

• 也可以用相应的无血清培养基稀释F03染料至所需浓度。
  
• 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度500～1000倍稀释，500～1000倍适合大多数细胞样本。
  
• 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光保存，一年稳定。
  
• 工作液需现配现用，避免反复冻存。
  
• 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。
  
• 若细胞在染色后不含染料的培养基中孵育，荧光信号会衰减。

• 悬浮细胞染色
  
  • 用PBS洗涤细胞2次。
    
    • 500×g离心5分钟。根据实验室平时离心细胞的离心力离心。
  • 加入适量体积的染色工作液重悬细胞，使其密度大约为1×10⁶/mL。
    
  • 在37℃孵育细胞20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
    
    • 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
  • 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续孵育40分钟。
    
  • 孵育结束，500×g离心5分钟。
    
    • 以下步骤均为洗涤细胞。根据实验室平时离心细胞的离心力和时间进行离心。
  • 弃上清液，再次缓慢加入37℃预热的HBSS重悬细胞。
    
  • 重复5,6步骤两次。
    
  • 加入HBSS重悬细胞，在37℃下再继续孵育20分钟。
    
  • 然后用该细胞进行荧光钙离子检测。
• 贴壁细胞染色
  
  • 用PBS洗涤细胞2次。
    
  • 细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。
    
    • 96孔细胞培养板每孔加入100μL染色液即可。
  • 37℃孵育细胞20～60分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
    
    • 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
  • 吸干染色工作液，用HBSS洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的HBSS覆盖所有细胞，然后吸干培养基。
    
  • 加入HBSS，在37℃下再继续孵育20分钟。
    
  • 然后用该细胞进行荧光钙离子检测。