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本制品是一种采用Hoechst 33258和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双荧光染色法进行细胞周期与细胞坏死分析的检测试剂盒。单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡，而且细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33258可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞与DNA结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强；对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡，PI不能穿透细胞膜，因此不能使细胞染色；而对于细胞膜完整性丧失的坏死细胞，PI可以穿透细胞膜使其着色，产生红色荧光。

Hoechst33258/PI双染后可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来，在二元直方图上，正常细胞对Hoechst33258具有拒染性，呈弱蓝色荧光＋弱红色荧光(Hoechst33258+/PI+)；凋亡细胞对Hoechst33258具有嗜染性，呈强蓝色荧光+弱红色荧光(Hoechst33258++/PI+)；坏死细胞对PI具有嗜染性，呈弱蓝色荧光＋强红色荧光；该试剂盒亦可用荧光显微镜进行观察，检测细胞含量范围一般为0.1～1×10⁶之间。

• 胰蛋白酶消化液、PBS
  
• 流式细胞仪或荧光显微镜、细胞计数板

• 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
  
• 在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。
  
• Heochst 33258与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min以内，太长容易引起Heochst 33258的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变。
  
• 如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化后，制备成单细胞悬液，才可以进行检测
  
• PI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 细胞样品的制备：
  
  • 贴壁细胞：
    
    • 小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。
      
    • 用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
      
    • 收集上述细胞悬液到离心管内，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL培养液，以免吸走细胞。
      
    • 加入约1mL提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
      
    • 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
  • 悬浮细胞：
    
    • 4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL培养液，以免吸走细胞。
      
    • 加入约1mL提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
      
    • 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
• 配制Cell Stain Buffer工作液：取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为Cell Stain Buffer工作液，4℃保存备用。
  
• 重悬细胞：取上述收集好的0.1～1×10⁶细胞，加入0.9mL Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
  
• Hoechst 33258/PI染色：
  
  • 一步法：加入5μL Hoechst 33258 Stain和5μL PI Stain，轻轻混匀，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
    
  • 两步法：
    
    • 加入5μL Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15min。
      
    • 置于冰水中冷却后，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。
      
    • 加入0.9mL Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
      
    • 加入5μL PI Stain，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
• 检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况；采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析；如果使用荧光显微镜检测，检测前4℃ 1000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤1次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，冰浴或4℃染色20～30min，染色后PBS洗涤1次，再在荧光显微镜下观察。