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神经HRP示踪显色液(DAB法)是动物经麻醉、注入HRP后，游离或络合型的HRP与氧化剂反应生成络合物，该络合物氧化供氢的DAB显色剂，呈棕色，在显微镜下清晰可见。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

上个世纪70年代，Kristensopn和Olsson报道了HRP可神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，经组织化学方法可显示出神经元的轮廓，从而开发出HRP追踪神经元示踪技术，即为HRP法。DAB是辣根过氧化物酶的常用底物，在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀不溶于水和乙醇，显色后呈棕色，可在显微镜下观察。

• 如果出现高的反应背景或沉淀，表明DAB底物反应过于强烈。
  
• 所用器皿必须洁净，避免含有氧化剂或还原剂，否则会产生非特异性反应。
  
• DAB显色液避免反复冻融，以免显色效率下降。
  
• DAB增强剂注意密闭保存，否则显色效率下降。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 准备工作
  
  • 动物麻醉：多用(3.5%)戊巴比妥钠作为麻醉剂，大鼠的麻醉剂量为0.25～0.35mL/100g。
    
  • 导入HRP：有压力注射法、电泳法以及周围神经系统的注射涂抹等法。
    
  • 确定动物存活期。
    
  • 动物灌注：麻醉后，经左心室升主动脉插管行心内灌注固定，先用生理盐水或PBS快速灌注；随后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，时间控制在30～40min；最后用10%蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)。
    
  • 取材：取组织置于20%的蔗糖磷酸盐缓冲液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸盐缓冲液备用。
• 显色反应
  
  • 配制DAB孵育液：取适量的DAB Assay Buffer和DAB显色液，按DAB Assay Buffer∶DAB显色液=39∶1的比例混合，即为DAB孵育液，即配即用，不宜保存。
    
  • 配制DAB显色工作液：取适量的DAB孵育液和DAB增强剂，按DAB孵育液∶DAB增强剂=2000～8000∶1的比例混合(具体比例应根据具体时间摸索确定)，即为DAB显色工作液，即配即用，不宜保存。
    
  • 配制1×DAB Wash Buffer：取适量的20×DAB Wash Buffer，按DAB Wash Buffer∶蒸馏水=1∶19的比例混合，即为1×DAB Wash Buffer；室温保存，6月有效。
    
  • 切片用蒸馏水清洗3次，每次2min。
    
  • 切片入10mL DAB孵育液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
    
  • 切片入10mL DAB显色工作液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
    
  • 漂洗：取10mL左右的1×DAB Wash Buffer漂洗切片2～3次，每次5min。
    
  • 贴片，载玻片用铬明矾明胶包被，室温空气干燥。
    
  • 脱水、透明步骤按如下操作：
    ① 蒸馏水10s
    ② 70%乙醇10s
    ③ 95%乙醇10s
    ④ 100%乙醇2次，每次10s
    ⑤ 二甲苯或脱蜡透明液透明2次，每次2～5min。
    
  • 中性树胶封片，显微镜下观察棕色反应。