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神经HRP示踪显色液(TMB法)是动物经麻醉、注入HRP后，游离或络合型的HRP与氧化剂反应生成络合物，该络合物氧化TMB显色剂，呈蓝色，在显微镜下清晰可见，该检测法较DAB法灵敏。该显色液仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

上个世纪70年代，Kristensopn和Olsson报道了HRP可神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，经组织化学方法可显示出神经元的轮廓，从而开发出HRP追踪神经元示踪技术，即为HRP法。3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)是非常优越的酶免试验显色剂，能溶解于多种有机溶剂和双蒸水中，为稳定的无色溶液，与适量过氧化脲或双氧水与缓冲液混匀后，与过氧化物酶作用产生清晰的蓝色产物，极易观察，在辣根过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝色沉淀，该沉淀不溶于水和乙醇，显色后呈蓝色，可在显微镜下观察。

• 如果出现高的反应背景或沉淀，表明TMB底物反应过于强烈。
  
• TMB显色工作液配置后会出现蓝色絮状颗粒，属于正常现象，使用时需要不断晃动，避免颗粒沉着于切片上，影响后续的观察。
  
• 所用器皿必须洁净，避免含有氧化剂或还原剂，否则会产生非特异性反应。
  
• TMB显色液避免反复冻融，TMB增强剂注意密闭保存，以免显色效率下降。
  
• Wash Buffer有挥发性气体，因此使用完要拧紧瓶盖，防止挥发失效。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 准备工作
  
  • 动物麻醉：多用(3.5%)戊巴比妥钠、速眠宁或10%水合氯醛等作为麻醉剂，对于戊巴比妥钠大鼠的麻醉剂量为0.25～0.35mL/100g。
    
  • 导入HRP：有压力注射法、电泳法以及周围神经系统的注射涂抹等法。
    
  • 确定动物存活期。
    
  • 动物灌注：麻醉后，经左心室升主动脉插管行心内灌注固定；先用生理盐水或PBS快速灌注；随后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，时间控制在30～40min；最后用10%蔗糖磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)灌注。
    
  • 取材：取组织置于20%的蔗糖磷酸盐缓冲液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸盐缓冲液备用。
• 显色反应
  
  • 配制TMB孵育液：取适量的TMB Assay Buffer和TMB显色液，按TMB Assay Buffer∶TMB显色液=39∶1的比例混合，即为TMB孵育液，即配即用，不宜保存。
    
  • 配制1×TMB Wash Buffer：取适量的20×TMB Wash Buffer，按TMB Wash Buffer∶蒸馏水=1∶19的比例混合，即为1×TMB Wash Buffer，室温保存，6月有效。
    
  • 切片用蒸馏水清洗3次，每次2min。
    
  • 切片入10mL TMB孵育液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
    
  • 将切片取出，配制TMB显色工作液：在用过的TMB孵育液中直接加入TMB增强剂，按TMB孵育液∶TMB增强剂=2000～8000∶1的比例混合(具体比例应根据具体实验摸索确定)，即为TMB显色工作液，即配即用，不宜保存。
    
  • 重新将切片浸入刚配置好的TMB显色工作液，20℃温育，避光孵育20min，不断晃动。
    
  • 漂洗：取10mL左右的1×TMB Wash Buffer漂洗切片2～3次，每次5min。
    
  • 贴片，载玻片用铬明矾明胶包被，室温空气干燥。
    
  • 脱水、透明步骤按如下操作：
    ① 蒸馏水10s；
    ② 70%乙醇10s；
    ③ 95%乙醇10s；
    ④ 100%乙醇2次，每次10s；
    ⑤ 二甲苯或脱蜡透明液2次，每次2～5min。
    
  • 中性树胶封片，显微镜下观察蓝色反应。