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本试剂盒是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比；细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡的分析；碘化丙啶染色后假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1～2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNAfragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。

细胞凋亡时流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型，细胞凋亡时出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常；在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化；在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低；细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。

本试剂盒经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死，其检测细胞含量范围一般为0.1～1×10⁶之间。

• 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
  
• 为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。
  
• 在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。
  
• 如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化后，制备成单细胞悬液，才可以进行检测。
  
• 细胞凋亡时，凋亡细胞的标志之一是DNA可染行降低，但这种情况并是绝对的，DNA含量的降低或者DNA与染料结合能力下降也会导致DNA可染行降低，在分析的时候应特别注意。
  
• PI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 细胞样品的制备：
  
  • 贴壁细胞：
    
    • 小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内，用胰蛋白酶消化细胞至可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
      
    • 收集上述细胞悬液到离心管内，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL培养液，以免吸走细胞。
      
    • 加入约1mL提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
      
    • 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
  • 悬浮细胞：
    
    • 4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL培养液，以免吸走细胞。
      
    • 加入约1mL提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
      
    • 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
• 细胞的固定：加入1mL冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃条件下固定2h或更长时间。4℃固定12～24h可能效果更佳。
  
• 细胞的清洗：
  
  • 4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL溶液，以免吸走细胞。
    
  • 加入约1mL提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
    
  • 小心吸取上清并丢弃，可留大约50μL PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
• PI染色：
  
  • 一步法：
    
    • 配制PI染色工作液：根据待检样品的数量，取适量试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)混合形成PI染色工作液，以下表配制。配制好的PI染色工作液4℃避光保存待用，24h有效。
      

      成分	1个样品	10个样品
      试剂(A):PI Stain Buffer	500μL	5mL
      试剂(B):PI Stain(20×)	25μL	250μL
      试剂(C):RNase A Solution(50×)	10μL	100μL
      总量	535μL	5.35mL

    • 在每个待检细胞样品中，加入500μL配制好的PI染色工作液，轻轻重悬细胞沉淀，置于37℃避光水浴30min。
  • 两步法：
    
    • 在沉淀细胞中加入40μL PBS和10μL RNase A Solution(50×)，置于37℃水浴30min。
      
    • 配制PI染色工作液：根据待检样品的数量，取适量试剂(A)、试剂(B)混合形成PI染色
      
    • 工作液，以下表配制。配制好的PI染色工作液4℃避光保存待用，24h有效。
      

    • 成分	1个样品	10个样品
      试剂(A):PI Stain Buffer	500μL	5mL
      试剂(B):PI Stain(20×)	25μL	250μL
      总量	525μL	5.25mL

    • 在每个待检细胞样品中，加入500μL配制好的PI染色工作液，轻轻重悬细胞沉淀，置于4℃避光30min。
• 检测与分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。