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SYTO9能对所有待测细菌(活菌+死菌)进行标记，而PI只能渗透进入到细胞膜受损的死菌，故在活菌中只有SYTO染料，故呈绿色荧光，而在死菌中同时有SYTO9和PI两种染料，故细菌呈红色荧光。在荧光显微镜下通过颜色即可分开两类细菌，通过检测两种荧光的比例可以反推出样本中活菌和死菌的比例。

• 适用于各种细菌，包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等等。
  
• 两种染料的最大激发和发射波长分别是480/500nm(SYTO9)和490/635nm(PI)。
  
• 本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。
  
• 本制品足够40次1mL细菌的荧光显微镜检测和流式细胞仪检测，200次100μL菌液的荧光酶标仪检测。
  
• 用于定量时需要自备制作标准曲线的细菌。
  
• 本制品只能用于科研。

• 第一次使用可将SYTO9和PI室温融化，低速短暂离心，然后根据单次用量分装
  
• 试剂C(Mounting oil)用于将细菌固定在膜上，25℃的折射率是1.517±0.003。不要误用作显微镜的浸油(Immersion oil)。
  
• SYTO9和PI均能够跟核酸结合，PI是已知的潜在诱变剂，目前没有数据表明SYTO9的诱变性或毒性，两种试剂使用都需做恰当防护。含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进行废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。成小份密封后置于≤-20℃避光保存。

• 制备活菌和死菌悬液(制作标准曲线用或对照用)
  
  • 用30mL营养肉汤培养大肠杆菌或其他细菌，使其生长至对数生长后期。
    
  • 于10000×g离心10分钟，吸弃上清液。
    
  • 用2mL自备的0.85% NaCl溶液重悬细菌沉淀。
    
  • 取1mL重悬菌液加入到20mL 0.85% NaCl溶液中(用作活细菌对照)，另外1mL加入到20mL 70%异丙醇中(用作死细菌对照)。
    
  • 两管样品于室温孵育1小时，每隔15分钟颠倒混匀一次。
    
  • 两管样品于10000×g离心10分钟。
    
  • 分别用20mL 0.85% NaCl溶液重悬两管细菌沉淀。
    
  • 于10000×g离心10分钟，吸弃上清液。
    
  • 分别用10mL 0.85% NaCl溶液重悬两管样品得到活菌和死菌样品。
    
  • 分别取3mL菌液测定OD₆₇₀的值(可用玻璃或丙烯酸酯比色皿，1cm路径)。
    
  • 根据不同后续实验进行下面的操作。
• 荧光显微镜检测
  
  • 在离心管内将SYTO9溶液和PI溶液按1∶1的体积比混匀得到染料混合液。
    
  • 取1mL活菌悬液和1mL死菌悬液(来字于步骤A.9)，各加入3μL染料混合液混匀，此作为活菌和死菌对照。同时，用0.85% NaCl溶液将待测样品制备成1mL悬液，也加入3μL染料混合液混匀。
    
  • 室温避光孵育15分钟。
    
  • 各取5μL染色的细菌悬液到载玻片上，并盖上18mm方形盖玻片后在荧光素滤光片下观察活菌(绿色荧光)和Texas Red滤光片下观察死菌(红色荧光)。
• 荧光光度计检测(以大肠杆菌为例)
  
  • 调整大肠杆菌活菌悬液和死菌悬液，使其密度均为10⁸个细菌/mL(OD₆₇₀=0.03)。
    
  • 按下表制备标准曲线样本：
    

    样本号	加入活菌(mL)	加入死菌(mL)	活菌比
    1	0	3	0%
    2	0.75	2.25	25%
    3	1.5	1.5	50%
    4	2.25	0.75	75%
    5	3	0	100%

  • 如果有N个待测样品，则准备(N+6)×9μL染料混合液A。染料混合液A由SYTO9溶液和PI溶液1：1充分混匀而成。多准备的5个用于标准曲线样品，多1个的量为富余量。
    
  • 在N个样品管和1～5号标准曲线样品内各加入9μL染料混合液A，用枪上下吹打数次使其混匀。
    
  • 室温避光孵育15分钟。
    
  • 以485nm为激发波长，530nm为发射波长(emission 1，绿色)来测定每个样品的绿色荧光，得到荧光值G。
    
  • 以485nm为激发波长，630nm为发射波长(emission 2，红色)来测定每个样品的红色荧光，得到荧光值R。
    
  • 计算每个样品的荧光比值G/R。
    
  • 以1～5号样大肠杆菌活菌比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比(RatioG/R)为纵坐标，制作标准曲线，用待测样品G/R比值倒推出其活菌比。
• 荧光酶标仪检测(以大肠杆菌为例)
  
  • 调整大肠杆菌活菌悬液和死菌悬液，使其密度均为10⁸个细菌/mL(OD₆₇₀=0.03)。
    
  • 按下表制备标准曲线样本：
    

    样本号	加入活菌(mL)	加入死菌(mL)	活菌比
    1	0	2	0%
    2	0.5	1.5	25%
    3	1.0	1.0	50%
    4	1.5	0.5	75%
    5	2	0	100%

  • 用0.85% NaCl溶液将测样品的细菌(死菌+活菌)浓度调到10⁸个细菌/mL待用。
    
  • 如果有N个待测样品，每个样品做三次重复，则需要准备3×(N+6)×100μL染料混合液B。多准备的5个用于标准曲线样品，1个为富余量。
    
  • 染料混合液B配制(以1mL为例)：3μL SYTO9溶液加3μL PI溶液，再加入2mL无菌水，充分混匀后即可。
    
  • 每个样品各取100μL悬液到一个96孔板中，每个样品做三个平行样(每个样品用三个孔)。96孔板的边缘孔空置以避免假读数。
    
  • 更换新的枪头，每孔加入100μL染色混合液B，上下吹打使充分混匀。
    
  • 室温避光孵育15min。
    
  • 以485nm为激发波长，530nm为发射波长(emission 1，绿色)来测定每孔荧光，得到荧光值G。
    
  • 以485nm为激发波长，630nm为发射波长(emission 2，红色)来测定每孔荧光，得到荧光值R。
    
  • 计算荧光比值G/R。
    
  • 以1～5号样大肠杆菌活菌比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比(G/R)为纵坐标，制作标准曲线，用待测样品G/R比值从标准曲线上倒推出其活菌比。