本制品是一种利用荧光探针DHE进行3D培养的细胞球或类器官中超氧阴离子活性氧检测的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官中超氧阴离子活性氧检测。通常仅需染色20分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中超氧阴离子活性氧红色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。
活性氧(ROS)主要包括超氧阴离子(·O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)等。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因素例如紫外照射、γ射线照射、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激，继而可能导致肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。
Dihydroethidium简称DHE，是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针，分子式为C21H21N3，分子量为315.41。可以直接用于活细胞的标记。Dihydroethidium被活细胞摄入后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生Ethidium。Ethidium (例如溴化乙锭)可以和RNA或DNA结合产生红色荧光。当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的Ethidium较多，红色荧光就较强，反之则较弱。这样就可以用Dihydroethidium进行超氧化物阴离子水平的检测。
Dihydroethidium本身为蓝色荧光，最大激发波长为370nm，最大发射波长为420nm，脱氢后和RNA或DNA结合产生红色荧光，最大激发波长为300nm，最大发射波长为610nm，实际观察时也可以使用535nm作为激发波长。
本试剂盒同时提供了DHE探针、阳性对照和检测缓冲液，使用更便捷。本试剂盒提供的DHE为500×储存液，该溶液经过优化，对大多数细胞都适用；超氧阴离子活性氧阳性对照试剂By3D Rosup II可短时间内诱导细胞活性氧生成。同时，本试剂盒提供了By3D DHE Assay Buffer，使用更便捷。
- 适用范围广：本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 使用便捷：整个检测过程仅需约30分钟即可完成。3D细胞球经超氧阴离子活性氧阳性对照试剂By3D Rosup II等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D DHE (500×)按照相应比例用By3D DHE Assay Buffer配制成By3D DHE检测工作液，避光孵育20分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
| 组分 | 200T | 1000T |
| By3D DHE (500×) | 40μL | 200μL |
| By3D Rosup II (500×) | 20μL | 100μL |
| By3D DHE Assay Buffer | 20mL | 100mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- BSA和酚红对DHE的检测有干扰，需避免。
- By3D DHE (500×)和By3D Rosup II (500×)第一次使用时请分装后-20℃保存，避免反复冻融。
- By3D DHE易在空气中氧化，请尽量避免暴露于空气中。
- By3D DHE脱氢后产生一定毒性的Ethidium，请注意防护。
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
- By3D DHE Assay Buffer经过过滤除菌处理，在使用时必须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果By3D DHE Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
- 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经超氧阴离子活性氧诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。如果后续用于荧光酶标仪检测，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- 3D细胞DHE检测工作液的配制：
- By3D DHE检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D DHE检测工作液的用量分别依次为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- By3D DHE检测工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D DHE检测工作液的量，用By3D DHE Assay Buffer稀释配制适量的By3D DHE检测工作液。
样品数 10个样品 50个样品 100个样品 By3D DHE (500×) 2μL 10μL 20μL By3D DHE Assay Buffer 1mL 5mL 10mL By3D DHE检测工作液 ~1mL ~5mL ~10mL - 配制By3D DHE检测工作液时注意避光，且需现配现用，稀释后不能长期保存。
- By3D DHE最优先的推荐终浓度为1×，对大多数细胞都适用，但为了得到更理想的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，By3D DHE的终浓度通常为0.5～2×。
- 本试剂盒提供的By3D DHE Assay Buffer可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好。
- By3D DHE检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D DHE检测工作液的用量分别依次为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 阳性对照的设置：将试剂盒中提供的超氧阴离子活性氧阳性对照By3D Rosup II (500×)按照推荐的1:500的比例加入到无血清细胞培养液中，通常处理细胞2～3小时即可，具体处理时间可以根据细胞种类适当调整。随后按照下述各种检测方法的步骤加入By3D DHE检测工作液，进行检测。
- 超氧阴离子活性氧阳性对照试剂By3D Rosup II可短时间内诱导细胞活性氧生成，终浓度通常为0.5～2×，最优先的推荐终浓度为1×。
- 仅在阳性对照孔中加入By3D Rosup II作为阳性对照，其余孔不能加入By3D Rosup II。
- By3D Rosup II可能对某些细胞效果较弱或者完全没有效果。
- DHE染色和检测：
- 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D DHE检测工作液。通常96孔板每孔加入100μL。37℃避光孵育20分钟。孵育时间可在10～30分钟之间进行调整。
- 如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37℃孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
- 检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察染色效果，或用荧光酶标仪检测，By3D DHE为红色荧光，Ex/Em=535/610nm。整个过程均需注意避光操作。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D DHE检测工作液。通常96孔板每孔加入100μL。37℃避光孵育20分钟。孵育时间可在10～30分钟之间进行调整。
图1.本试剂盒对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，1×By3D Rosup II诱导细胞球2小时，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D DHE检测工作液，染色20分钟。结果显示，By3D超氧阴离子活性氧检测试剂盒(DHE)对于By3D Rosup II诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D DHE染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、F)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(C、G)。3D细胞Hoechst 33342染色液需自备。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。
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