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产品组成：
产品简介：
本试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶溶液消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从10天左右的小麦幼苗中分离原生质体。获得的细胞可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，研究蛋白的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次20mL酶解液的使用量，可供5次/10次原生质体制备以及25次/50次转化反应。
使用说明：
一、准备工作
1.需要准备的材料(本试剂盒不提供)：
锋利刀片；血球计数板；50mL离心管；2mL离心管
2.即用型酶解液配制
注：根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌，在三小时内游离原生质体可以不经过过滤除菌。
二、原生质体的分离制备
1.短日照条件下，水培小麦幼苗7～14天。
2.用锋利的刀片取小麦的叶片15～30片，不要茎秆和叶尖。将叶片横向(平行主叶脉)切成0.5～1.0mm宽的细条(去掉主叶脉)。
注：切叶片时可以将3～5片叶叠在一起，不要过多，避免拖拽，以防破坏原生质体。
3.切好的小麦细条放入装有20mL酶液的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞，抽真空10分钟(15Hg/50kpa/0.5)。
4.避光室温40～50rpm摇床上摇动3h。收集原生质体前，100rpm摇动1～5min(可以每隔5分钟用手轻轻晃动3～5次)，让细胞完全释放出来(肉眼可见器皿中有浓绿色溶液浸出)。
注：黄化苗酶解后原生质体不呈绿色，酶解完成后，可以取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做；如果细胞扁且发黑，则弃去。
5.酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻夹取酶解物帮助充分释放原生质体，去除未消化的叶片组织。用10mL预冷的溶液II-W5 solution冲洗酶解器皿和未消化的叶片2～3次，将所有的液体收到50mL离心管中。
注：操作过程中尽可能动作要轻柔，避免剧烈震荡，防止原生质体破碎。
6.选用水平转头，100g离心2min，升速3，降速3，去除上清。
注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。建议升速和降速分别都使用3。
7.用10mL预冷的溶液II-W5 solution温柔重悬位于底部的原生质体，用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起，150g离心2min，升速3，降速3，去上清。
8.加入1mL预冷的溶液II-W5 solution，重悬原生质体，冰上静置30min。
9.在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。
注：如原生质体呈现圆球形，叶绿体分散在整个细胞内，说明状态较好；如呈现不规则形状，说明原生质体破碎或即将破碎。
血球计数板的使用：
如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是1mm的方形区域进行计数(25个中方格)。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以25(正方形被分成了25个小正方形)，计算该区域的细胞数量，该区域的体积为0.1μL(长1mm，宽1mm，高0.1mm)。计算获得的细胞数量。原生质体密度(个/mL)=25个中方格原生质体数×10⁴×稀释倍数。
10.100g离心1min，升速3，降速3，去上清，用相应体积的MMg溶液重悬原生质体，调整原生质体密度为2×10⁵/mL。(如细胞量较少，可以将所有细胞用于1～2个转化体系)
三、原生质体的转化
1.在2mL的圆底离心管中加入10μL(10～20μg)纯化后的质粒，随后加入100μL已调整好浓度的原生质体，轻轻混匀，再加入110μL溶液IV-PEG solution，旋转离心管，或使用剪尖蓝枪头(1mL吸头)轻轻吸打，直至混匀，此过程中避免产生气泡，28℃放置3～30min。(常规实验约需15min，间歇轻柔混匀)
2.加入1.6mL预冷的溶液II-W5 solution，轻柔混匀，终止转化。常温150g离心2min，升速3，降速3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去掉上清。
3.加入2mL预冷的溶液II-W5 solution悬浮原生质体，常温150g离心2min，升速3，降速3，去上清。
四、原生质体的培养和收集：
1.加入2mL预冷的溶液II-W5 solution悬浮细胞。将离心管水平放置于光照培养箱中(28℃)，避免强光照，孵育16h。
2.收集细胞时，缓慢将离心管拿起，用枪头轻柔的将附着在管壁上的细胞悬起，离心管室温垂直静置几分钟后再离心，150g离心2min，升速3，降速3，去除大部分预冷的溶液II-W5 solution，富集细胞，用于后续实验。
注意事项：
1.分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能的轻柔。
2.为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用平角转头。
实验过程中尽可能使用剪尖蓝枪头(1mL吸头)，因为其尖端的孔径较大；或把黄色枪头的尖端剪掉，并保证平滑。
相关搜索：小麦原生质体制备及转化试剂盒(20 mL/T)