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本试剂盒适用于从各种植物样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。

• 使用方便，无需超速离心，省时省力。
  
• 纯度高，富集量大，应用范围广。
  
• 获取的Exosome结构和功能完整。
  
• 稳定性好，便于运输，便于保存。

• 仪器准备：离心机、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：PBS缓冲液、纯水
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 不同样本的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的样本。
  
• 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

• 清洗外泌体纯化离心管C
  
  • 用缓冲液或纯水进行预清洗。
    
  • 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用前移除并稍微离心甩干。
• 样品处理
  
  • 收集500mg～1g新鲜的待提取植物样品，根据不同样品进行剥皮、彻底清洗等处理，置2～8℃保存。
    
  • 在样品中加入1～2mL外泌体提取液A，然后用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
    
  • 将匀浆液1000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。
    
  • 将样品在4℃条件下，3000×g离心30分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。
    
  • 将样品在4℃条件下，12000×g离心60分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。即得到待提取植物匀浆液（0）。
• 外泌体粗提
  
  • 将待提取植物匀浆液（0）上清吸入离心管D中，套上液体收集管，在4℃，10000×g条件下离心5～10分钟。
    
  • 将液体收集管中的液体吸入另一干净离心管。在4℃，16000×g条件下离心20分钟。弃沉淀，收集上清。即为1～2mL外泌体粗提液（I）。
    
  • 将外泌体粗提液（I）吸入另一干净离心管。在4℃，16000×g条件下离心20分钟。弃沉淀，收集上清。即为1～2mL外泌体粗提液（II）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。
• 外泌体纯化
  
  • 将外泌体纯化离心管C（大）内管插入所提供的一个配套离心管中。
    
  • 向内管中加入2mL的外泌体粗提液（II）样本，并盖上盖子。
    
  • 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
    
  • 以4000～10000×g离心约10～30分钟。离心至大约剩余100μL液体。
    
  • 在50～100μL残余液体中加入1mL外泌体提取液B。
    
  • 以4000～10000×g离心约10～30分钟。离心至大约剩余100μL液体。
    
  • 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
    
  • 为了回收纯化后的外泌体，用200μL移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的约100μL纯化外泌体悬液，即得到外泌体样品纯品。。
    
  • 用纯水或缓冲液洗涤离心管C的内管和收集管，继续纯化下一个样品。
• 外泌体纯化离心管C（大）清洗和保存
  
  • 使用后用水冲洗干净；
    
  • 内管加入超纯水4mL，4000×g离心5分钟；
    
  • 吸净内管中的水，加入4mL 0.1M NaOH，4000×g离心20分钟；
    
  • 用0.1M NaOH浸泡24小时；
    
  • 用水冲洗干净；
    
  • 用无菌水浸泡2～8℃保存。
    
  • 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

• 准备做植物外泌体研究，初始样品量需要准备多少？
  不同样本外泌体含量差异较大，根据文献选择起始样本量。有条件的情况下尽可能使用多一点样本量。
  
• 如何鉴定提取的外泌体？
  通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。
  
• 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
  没有，该检测属于定性检测。
  
• 蛋白浓度低？
  很多样本外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大植物样本的上样量。
  处理部分外泌体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
  
• 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
  不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约20μL。
  
• 可以重复使用过滤管么？
  可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。