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传统的血清/血浆中分离和提取exosome的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要30～70个小时，每次最多只能处理6个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。
我公司自主开发的总外泌体提取试剂盒(血清/血浆用)适用于从各种血清/血浆样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游应用实验。
本试剂盒按每个样本处理2mL血清/血浆计，每个50T试剂盒大约可以用于提取100mL血清/血浆。如果需要处理大量的血清/血浆，将提取液按说明书标准操作的体积等比例调整即可。


● 使用方便，无需超速离心，省时省力；
● 纯度高，富集量大，应用范围广；
● 获取的Exosome结构和功能完整；
● 稳定性好，便于运输，便于保存。

组份	20T	50T
组份A：外泌体提取液A	40mL	100mL
组份B：外泌体提取液B	40mL	100mL
组分C：外泌体保存液C	15mL	30mL
组分D：外泌体纯化离心管D(大)	4套	10套
组分E：外泌体纯化离心管E(小)	4套	10套
说明书	1份	1份

2～8℃保存，有效期1年。


●离心机(可以离心15mL圆锥形离心管) ●移液器(200μL) ●离心管●吸头


● 以下以2mL血清/血浆为例，实际操作时按血清样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。
● 不同血清/血浆样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择血清/血浆样本量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
● 常规血清/血浆样本最佳上样量为3～5mL及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
● 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。


外泌体提取：
1.收集2mL待提取的血清/血浆样品，置2～8℃保存。
注：
● 冻存样品解冻后置2～8℃保存。
2.将样品在4℃条件下，3000g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3.小心将上清移入另一干净离心管中。
4.将样品在4℃条件下，10000g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5.小心将上清移入另一干净离心管中。
6.在2mL血清/血浆样品中加入2mL提取液A，盖紧离心管盖。
7.轻轻上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。制备成4mL待提取外泌体悬液(I)。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。
清洗外泌体纯化离心管D(大)：
1.用缓冲液或纯水进行预清洗。
2.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
注：
● 可以在外泌体提取步骤中需要使用前再清洗。
● 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。
外泌体纯化：
1.将外泌体纯化离心管D(大)内管插入所提供的一个配套离心管中。
2.向内管中加入过4mL的待提取外泌体悬液样本，并盖上盖子。
注：
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头(1mL)；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头(200μL)。
3.将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
注：
● 最好使用非固定角度的转子。
● 使用固定角度转子时，将白色膜片面朝上放置。

4.以4000×g离心约10～15分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
注：
● 离心至大约剩余50μL～100μL液体即可，不要过度浓缩。
● 如果外泌体样本的起始浓度很高，请监控离心过程，以免样本过度浓缩。过度浓缩会导致沉淀，这也可能带来样本损失。第一次做新样品时，可以离心几分钟后观察剩余液体大概体积。
● 建议将滤过液吸入带盖的离心管(自备)中保存，一直保留到外泌体的样品分析测试完成。避免吸头戳破滤膜导致外泌体损失。
● 影响流速的因素包括样本浓度、相对离心力、离心转子角度以及温度。常见样本的典型离心时间大约10～20分钟。大部分样本在离心开始后的前5～10分钟发生过滤纯化，但在离心10～20分钟后才能达到最低纯化液体积(20μL)。
● 可以将浓缩的外泌体用PBS或HEPES等缓冲液(根据下游实验需要选择)稀释，再次离心至大约剩余50μL～100μL，这样的外泌体纯度将再次提高，残余的外源蛋白质和核酸更少。
5.在50～100μL残余液体中加入2mL外泌体提取液B。
6.以4000×g离心约10～15分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
注：
● 离心至大约剩余50μL～100μL液体即可，不要过度浓缩。
● 如果外泌体样本的起始浓度很高，请监控离心过程，以免样本过度浓缩。过度浓缩会导致沉淀，这也可能带来样本损失。第一次做新样品时，可以离心几分钟后观察剩余液体大概体积。
● 建议将滤过液吸入带盖的离心管(自备)中保存，一直保留到外泌体的样品分析测试完成。避免吸头戳破滤膜导致外泌体损失。
7.离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
注：
● 外泌体可能会有少量的吸附损失，吸附损失取决于外泌体浓度、与过滤纯化内管表面接触的温度和时间。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收过滤后的外泌体样本。
8.为了回收纯化后的外泌体，用200μL移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50～100μL纯化外泌体悬液(II)。
注：
● 要达到理想的回收效果，请尽快吸出纯化外泌体悬液。
● 从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 注意确保外泌体悬液完全吸出。
9.套上外泌体纯化离心管E(小)的液体收集管，将纯化外泌体悬液(II)吸入外泌体纯化离心管E(小)的离心管(内管)中，在4℃,11000～13000g条件下离心10～15分钟。
注：
● 外泌体纯化离心管E(小)重复利用，一般一个柱子可以用5～20次。
● 外泌体纯化离心管E(小)对外泌体没有吸附，离心后可以直接使用。
● 如果需要清洗离心柱，可以加入PBS用移液器吹打，吸掉PBS。再次加入新的PBS，在10000g离心10分钟即可。
10.吸取外泌体纯化离心管E(小)的收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
注：
● 可以根据下游实验需要，用相应的缓冲液稀释保存外泌体。
● 也可以用试剂盒中配的外泌体保存液稀释保存外泌体。
● 也可直接用于蛋白提取。
● 将外泌体样本-80℃保存或直接用于下游应用。
● 外泌体短期保存可以置于2～8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。
● 保存前可以用0.22μm或0.35μm滤器过滤除菌。
11.用纯水或缓冲液洗涤两种大小内管和收集管，继续纯化下一个样品。
注：
● 洗涤内管时，加入400μL PBS缓冲液或其它缓冲液，用吸头反复吹打，吸掉缓冲液即可。
● 用PBS洗涤3～4次。
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 每个离心管内管建议重复使用5次，不要超过10次。
● 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
● 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。
外泌体纯化离心管(大)清洗和保存：
1.使用后用水冲洗干净；
2.内管加入超纯水500μL,5000g离心5分钟；
3.吸净内管中的水，加入500μL 0.1M NaOH,5000g离心20分钟；
4.用0.1M NaOH浸泡24小时；
5.用水冲洗干净；
6.用无菌水浸泡2～8℃保存。
7.外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。
注：
● 1个月不用的话，直接用100mM的NaOH保存！更长时间的话加0.02%的叠氮钠。
● 再次使用前，用纯水充分冲洗干净，然后根据下游实验需要，用相应的缓冲液平衡。


● 采用血浆还是血清来源的外泌体？
对于大多数涉及到Exosome RNA分离的研究，我们推荐使用血浆。因为血清收集后在凝血过程中，血小板受到刺激会产生许多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中获得的小泡始终比血浆中多，甚至超过50%的小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下Exosome更好的介质。多数的criculating Exosome研究样本使用的是血浆。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8～10次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放，并记录实验室中存放的时间，因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要，建议在30min内完成，长时间的存放，而没有及时处理会导致血小板细胞Exosome的进一步释放。血液要尽快处理，在室温条件下分离血浆(或者血清)。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。
● 怎样选择抗凝剂？
抗凝剂有一个或多个形式的功能，包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般选用EDTA抗凝。其它有许多抗凝血剂可用，但不建议使用肝素抗凝剂。无论是外源性或内源性起源(例如肥大细胞)，肝素会抑制下游PCR反应，因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外，肝素可抑制Exosome与靶细胞的结合，抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。对于珍贵样本，可能需要从肝素化的血液样品中提取RNA。核酸的检测需要通过调整PCR的敏感性。另外如果Exosome相关核酸被发现只存在于Exosome内，在RNA分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾，或柠檬酸三钠(加入/不加右旋糖或茶碱、腺苷和双嘧达莫)就更复杂了，最好根据下游的试验来指导。CTAD阻碍血小板活化和随后的Exosome释放。EDTA可干扰PCR反应(尽管程度低于肝素)，但它的存在可能是无害的。另外，下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。
● 采血管的选择方法？
血浆采用紫盖采血管(EDTA-K2或EDTA-K3)，例如BD货号：367841～2mL 367862～4mL 367863～6mL 366643～10mL等；血清采用黄盖采血管(促凝管或促凝管带分离胶)，例如BD货号：366566～5mL 367985～10mL等。
● 如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。
● 外泌体WB标志蛋白用什么？
在进行WB检测时，通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101、ALIX、HSP70等。
● 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。
● 蛋白浓度低？
很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
● 抽提得到的RNA浓度低？
很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。
● 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10～20μL。
● 可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。
● 外泌体在纯化时出现了沉淀，如何改进？
如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的外泌体浓度很高，建议降低最终的外泌体浓度，保留更多的液体。
对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：
1)离心力降低30%～50%；
2)在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。
● 有时候用外泌体纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。
最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。
● 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到外泌体的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
可以，但是低温可能会增加外泌体样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。
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