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本制品是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低速离心除去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。

• 胰蛋白酶
  
• 低温离心机、匀浆器
  
• PBS

• 细胞计数(如台盼蓝染色液)对于不同实验不必全部使用，实验条件成熟后可以不用。
  
• 如果不是用于制备线粒体蛋白，Mitochondria Lysis Buffer和Wash Buffer中不必加入PMSF。
  
• 如果用于制备线粒体蛋白样品，Mitochondria Lysis Buffer和Wash Buffer中需添加PMSF。
  
• PMSF一定要在试剂加入到样品中前1～2min内加入，以免PMSF在水溶液中失效。
  
• 分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷，全部操作时间尽量控制在1h以内。
  
• 通常在分离线粒体时前后两次离心速度选取1000g和15000g，如果希望纯度更高，但对线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可用2000g和6000g。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 清洗：用预冷的PBS清洗细胞1次，4℃ 1000g离心5min，弃上清。
  
• 裂解：沉淀用1～2mL预冷的Mitochondria Lysis Buffer重悬细胞，冰浴放置10～15min，可用相差显微镜检测膨胀的程度。
  
• 匀浆：把细胞悬液转移至Dounce匀浆器中，匀浆10～20次；不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
  
• 取匀浆液，立即加入等量Wash Buffer，轻轻颠倒混匀数次。
  
• 4℃ 1300g离心5min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
  
• 上清液转移至一干净离心管，4℃ 1000g离心5min，重复2次。
  
• 上清液转移至一干净离心管，4℃ 12000～15000g离心15min，重复1次。
  
• 弃上清，沉淀为线粒体。如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀，随后把收集的上清12000g 4℃离心10min，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。
  
• 保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体沉淀应重悬于Mitochondria Stock Buffer；如果用于细胞浆蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于1×Protein Stock Buffer，即按细胞浆蛋白：Protein Stock Buffer (5×)=4：1比例混合；如果用于双向电泳，应使用恰当的保存液。