产品货号：
BTN111208
中文名称：
植物线粒体纯化试剂盒
英文名称：
Plant Mitochondria Purification Kit
产品规格：
5次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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植物线粒体是重要的植物细胞器，负责ATP的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗传研究都需要进行线粒体纯化。本制品就是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒。
产品特点：
1.即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2.提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析，也可以用于PCR级别的线粒体DNA和RNA提取。
3.精提利用冷冻超速离心（离心力达40000g）制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA和RNA提取。
4.本制品足够5次提取，每次可处理10g绿色植物组织（可得1～2.5mg左右线粒体）或20g非绿色植物组织（可得2～5mg左右的线粒体）。
产品组成：
保存条件：常温，有效期一年。
自备试剂：超纯水，可能需要5MKOH调pH，如果需要去除细胞核DNA，还需要自备25mMMgCl2溶液、0.5MEDTA溶液、DNase干粉和另购更多洗涤液。
使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。
一：选择组织
1.植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：
2.一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3.一次实验需要40mL匀浆液、约90mL洗涤液和35mL密度梯度离心介质（配制方式是一次性将9.8g (8.7mL) Percoll加入到26.3mL离心介质溶液中，充分混匀后得到35mL密度梯度离心介质）。这三种溶液用前均需要加入BSA干粉使其终浓度为0.1%（100mL溶液加0.1g BSA干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA干粉加入，否则容易长菌。
二：线粒体粗提操作流程
1.将10g的绿色植物组织（如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织）或20g干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL匀浆液（需先加0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集，否则线粒体产率将急剧降低。
2.将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring匀浆器中，中速匀浆3次，每次15秒，每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3～4分钟。
注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5M KOH将pH调到7.0以上才进入下一步。
3.用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4.在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000g离心5分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL塑料离心管中。
5.将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12000g离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
6.加入10mL预冷的洗涤液（需先加0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
7.将线粒体重悬液转移到新的50mL离心管中，再加入30mL预冷的洗涤液（终体积为40mL）中，4℃ 1000g离心5分钟。线粒体将在上清中。
8.将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000g离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15～30%。
9.在沉淀中加入2mL预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4管线粒体沉淀重悬在2mL洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45～75%。
10.所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜，质体，过氧化物酶体，乙醛酸循环体，或细菌）污染，但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取、呼吸链功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20体积的自备DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三：细胞核DNA的去除（纯化测序级的线粒体DNA才需要进行此操作。本制品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
11.预留50μL线粒体粗提液做对照，在约2mL剩余的线粒体粗提液中加入40μL25mM的MgCl2，再加入200μg DNase干粉或溶液（总量为200μg即可），混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品（如50μL）在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase，再取其中的10μL和10μL预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR，如果DNase处理的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA去除比较干净（达到PCR检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR检测不到细胞核DNA。
12.加入0.32mL预冷的自备0.5M的EDTA溶液和40mL预冷的洗涤液。
13.4℃ 1000g离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000g离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2mL洗涤液中。
四：线粒体精提操作方案（需要40000g的超速冷冻离心机）
14.在50mL预冷的塑料离心管中先后加入35mL预冷的密度梯度离心介质（配制方法见第三步，用前需先加0.1% BSA）。
15.将2mL线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16.在超速水平离心机上4℃ 40000g离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
17.用广口吸管（可将1mL蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
18.在15～20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的洗涤液。
19.转入50mL塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，沉淀为线粒体。
20.将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少4倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在5～15%。
21.将精提的线粒体重悬在1mL预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上最多可放置5～6小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20体积的DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五：线粒体后续处理（本制品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
22.DNA提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的SDS-蛋白酶K酶解，酚氯仿抽提，乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体DNA。也可以用细菌DNA提取的试剂盒制备DNA。
23.RNA提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的Trizol方法制备线粒体RNA。
24.总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。
25.线粒体内膜，外膜、基质纯化：请自备方法。
26.其他功能检测：请自备方法。
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产品特点：
1.即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2.提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析，也可以用于PCR级别的线粒体DNA和RNA提取。
3.精提利用冷冻超速离心（离心力达40000g）制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA和RNA提取。
4.本制品足够5次提取，每次可处理10g绿色植物组织（可得1～2.5mg左右线粒体）或20g非绿色植物组织（可得2～5mg左右的线粒体）。
产品组成：
| 组分 | 编号 | 规格 |
| 匀浆液 | BTN111208A | 250mL |
| 洗涤液 | BTN11208B | 250mL×2 |
| 离心介质溶液 | BTN11208C | 150mL |
| Percoll | 17-0891-09 | 50mL |
| BSA干粉 | 048-46-8 | 10g |
| 带柄尼龙筛 | 1只 | |
| 软毛笔 | 1只 |
保存条件：常温，有效期一年。
自备试剂：超纯水，可能需要5MKOH调pH，如果需要去除细胞核DNA，还需要自备25mMMgCl2溶液、0.5MEDTA溶液、DNase干粉和另购更多洗涤液。
使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。
一：选择组织
1.植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：
| 植物组织种类 | 线粒体产率 | 说明 |
| 根和块茎 | 0.3mg/10g | 如土豆，红薯等 |
| 黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘） | 2～5mg/10g | 多酚含量低于叶片 |
| 光合作用的叶片和子叶 | 1～2.5mg/10g | 需放置在暗处3天 |
2.一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3.一次实验需要40mL匀浆液、约90mL洗涤液和35mL密度梯度离心介质（配制方式是一次性将9.8g (8.7mL) Percoll加入到26.3mL离心介质溶液中，充分混匀后得到35mL密度梯度离心介质）。这三种溶液用前均需要加入BSA干粉使其终浓度为0.1%（100mL溶液加0.1g BSA干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA干粉加入，否则容易长菌。
二：线粒体粗提操作流程
1.将10g的绿色植物组织（如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织）或20g干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL匀浆液（需先加0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集，否则线粒体产率将急剧降低。
2.将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring匀浆器中，中速匀浆3次，每次15秒，每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3～4分钟。
注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5M KOH将pH调到7.0以上才进入下一步。
3.用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4.在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000g离心5分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL塑料离心管中。
5.将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12000g离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
6.加入10mL预冷的洗涤液（需先加0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
7.将线粒体重悬液转移到新的50mL离心管中，再加入30mL预冷的洗涤液（终体积为40mL）中，4℃ 1000g离心5分钟。线粒体将在上清中。
8.将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000g离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15～30%。
9.在沉淀中加入2mL预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4管线粒体沉淀重悬在2mL洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45～75%。
10.所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜，质体，过氧化物酶体，乙醛酸循环体，或细菌）污染，但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取、呼吸链功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20体积的自备DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三：细胞核DNA的去除（纯化测序级的线粒体DNA才需要进行此操作。本制品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
11.预留50μL线粒体粗提液做对照，在约2mL剩余的线粒体粗提液中加入40μL25mM的MgCl2，再加入200μg DNase干粉或溶液（总量为200μg即可），混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品（如50μL）在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase，再取其中的10μL和10μL预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR，如果DNase处理的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA去除比较干净（达到PCR检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR检测不到细胞核DNA。
12.加入0.32mL预冷的自备0.5M的EDTA溶液和40mL预冷的洗涤液。
13.4℃ 1000g离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000g离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2mL洗涤液中。
四：线粒体精提操作方案（需要40000g的超速冷冻离心机）
14.在50mL预冷的塑料离心管中先后加入35mL预冷的密度梯度离心介质（配制方法见第三步，用前需先加0.1% BSA）。
15.将2mL线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16.在超速水平离心机上4℃ 40000g离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
17.用广口吸管（可将1mL蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
18.在15～20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的洗涤液。
19.转入50mL塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，沉淀为线粒体。
20.将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少4倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在5～15%。
21.将精提的线粒体重悬在1mL预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上最多可放置5～6小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20体积的DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五：线粒体后续处理（本制品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
22.DNA提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的SDS-蛋白酶K酶解，酚氯仿抽提，乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体DNA。也可以用细菌DNA提取的试剂盒制备DNA。
23.RNA提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的Trizol方法制备线粒体RNA。
24.总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。
25.线粒体内膜，外膜、基质纯化：请自备方法。
26.其他功能检测：请自备方法。
相关搜索：植物线粒体纯化试剂盒，Plant Mitochondria Purification Kit