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Y190感受态细胞图片
产品货号:
KD1163
中文名称:
Y190感受态细胞
英文名称:
Y190 Chemically Competent Cell
产品规格:
10×100μL
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

保存:-80℃

产品储存:-80℃保存,6个月有效。
产品组成:
基因型:
MATa,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,cyhr2,LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3,MEL1 URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ
产品说明:
Y190菌株是GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为:trp1,leu2,cyh2;报告基因为:lacZ,HIS3,MEL1。Y190-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:(pGB和pACT2)或(pGBKT7和pGADT7)。质粒pGB由pGBKT7改造而来,筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒pACT2与pGADT7的结构和功能类似,筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成bait融合蛋白(bait–BD)和prey融合蛋白(prey-AD),如果bait和prey发生相互作用,就会促使BD和AD的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。Y190感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存六个月,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
使用方法:
1.取Y190感受态细胞100μL于冰上融化,依次加入预冷的目的质粒2~5μg,Carrier DNA (95~100℃,5min,快速冰浴,重复一次) 10μL,PEG/LiAc 500μL并吸打几次混匀,30℃水浴30min (15min时翻转6~8次混匀)。
2.将管放42℃水浴15min (7.5min时翻转6~8次混匀)。
3.5000rpm离心40 s弃上清,ddH2O 400μL重悬,离心30 s弃上清。
4.ddH2O 50μL重悬,涂板,29℃培养48-96h。
注意事项:
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y190酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27~30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。
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