产品货号：
KD0569
中文名称：
KM71H感受态细胞(化转)
英文名称：
KM71H Chemically Competent Cell
产品规格：
10×100μL
发货周期：
1～3天
产品价格：
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保存：-80℃
产品储存：-80℃保存
产品组成：
注：本菌株的基因型：aox1::ARG4,arg4，表型：MutS,Arg+。
产品说明：
KM71H是毕赤酵母菌株，属于真核细胞。一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了防止大肠杆菌等原核生物对酵母培养菌株污染，往往会在培养基中加入一些氨苄和卡那霉素的抗生素，来抑制细菌菌的污染和生长。毕赤酵母适宜的生长温度是28至30℃，温度超过32℃对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。KM71H毕赤酵母被推荐用来表达含有Zeocin抗性的载体载体重组质粒，例如pPICZ A,B,C系列的载体。在筛选KM71H重组转化菌株时，Zeocin抗生素的工作浓度是100μg/ml。
KM71H宿主菌中的AOX1基因含有一个片段缺失，当pPICZ A,B,C或者pPICZα A,B,C转化到KM71H中时只能产生出MutS转化株，不必在进行Mut基因型的筛选了。KM71H的来源母细胞在精氨琥珀酸裂解酶基因(arg4)含有一个突变，这使得菌株无法在不含有精氨酸的培养基中生长。而KM71H酵母细胞中在AOX1基因处插入了一个正常的arg4基因，从而形成了KM71H的MutS,Arg+表型。将约2kb的Arg4基因克隆出来后插入到KM71H来源菌株内的野生型的AOX1基因的BamH I(16bp)和Sal I(227bp)中间，从而构建成功KM71H。ARG4基因直接替换了AOX1基因的16～227片段序列。KM71H毕赤酵母细胞的优点是不需要利用甲醇minimal media筛选菌株的Mut基因型，因为所有的转化株都是MutS菌株。另外，AOX1基因并没有被完全删除，理论上你可以用自己的基因替换其中的Arg4基因，从而生成MutS,Arg-的转化株，但是由于实验表明该基因型酵母菌株在含有精氨酸的minimal media上并不能很好的生长，所以并不鼓励大家进行这种基因替换尝试。
使用方法：
1.取0.1～5μg质粒DNA(线性化质粒加入量5～50μg)和10μL预变性Carrier DNA，加入到未融化的100～200μL感受态细胞上，置于30℃水浴，每隔15 S颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化(融化后及时取出)。
2.加入1.4mL B2溶液颠倒混匀。30℃水浴60min，每隔20min颠倒混匀
3.3000rpm离心3min弃上清留菌体沉淀，加入1mL B3溶液重悬菌体。
4.3000rpm离心3min弃上清留菌体沉淀，加入100μL B3溶液重悬菌体。
5.将100μL菌液全部涂布到相应的平板培养基，30℃恒温培养3～5天，直至平板出现酵母克隆。
注意事项：
1.初次使用Carrier DNA，请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5min，然后立即放在冰上，用后放在-20℃储存备用。下次使用前请于冰上解冻Carrier DNA。反复冻融3～5次后需重新变性Carrier DNA。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.毕赤酵母适宜的生长温度是28至30℃，温度超过32℃对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。
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