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本试剂盒是基于探针法荧光定量PCR技术开发的，可用于研究检测食品或其他材料中是否有鸡源性成分。

现代食品加工工艺极大改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的、快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。此外还有很多情况需要检测非食品样本中是否有鸡源性成分，为此我公司开发了本试剂盒。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，灵敏度高，最低检测限可达100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据鸡基因组DNA高度保守区设计，不会跟其它生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时，线性范围至少5个数量级。
   
6. 本制品只能用于科研，足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

鸡源性成分qPCR引物-探针干粉在使用前需要离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头(下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡混匀1分钟，得到10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡混匀1分钟，得到10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 依次重复上面的操作得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	标曲样品管 (1-6)
    2×Probe qPCR MasterMix	各10μL	10μL	各10μL
    鸡源性成分qPCR引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
    待测样本DNA模板	各7μL	不加	不加
    超纯水	不加	7μL	不加
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	不加	不加	各7μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	10min
    PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min(采集FAM通道荧光信号， 淬灭基团为MGB)

12. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
    
13. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
    
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。