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D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。其作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。目前市场上有三种产品形式，D-荧光素（游离酸），D-荧光素钠盐，以及D-荧光素钾盐。这三种产品主要的差别在于溶解特性上。D-荧光素（游离酸）水溶性以及缓冲体系的溶解性都很弱，除非溶于弱碱如NaOH和KOH溶液，溶于甲醇（10mg/mL）和DMSO（50mg/mL）。钠盐和钾盐形式的D-荧光素能够非常容易且快速的溶入水或者缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成液体后的这三种产品，在绝大多数的应用上都没有实质性的差别。

• 本制品（firefly luciferin）和甲虫荧光素（beetle luciferin）都是指化合物(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-
  carboxylic acid，仅仅是不同公司在命名上的差异。
  
• 本品保存和操作的过程中都要避光。另外储存液过滤除菌后，可以-20℃或-80℃分装冻存，避免反复冻融。如果有条件，对储存液充氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间更长，长达1年。
  
• 注射方式，动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳的检测时间。

• 体外生物发光检测
  
  • 用稀碱（如NaOH，KOH溶液）溶解D-荧光素，游离酸，配制成30mg/mL的储存液（200×），并调整pH至7.4。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。
    注：如果有沉淀发生则需要调整pH至更高直至完全溶解。之后可以重新用酸性溶液来中和，调整至pH7.4。
    
  • 用预热好的组织培养基1:200稀释储存液，配制工作液（终浓度150μg/mL）。
    
  • 去除培养细胞的培养基直至无残留。
• 活体成像分析
  
  • 用稀碱（如NaOH，KOH溶液）配制D-荧光素工作液（15mg/mL），并调节pH至7.4，0.2μm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。
    
  • 注射量取决于注射方式，具体如下：

    注射方式	剂量
    静脉注射（25-27gauge针头）	按10μL/g体重浓度，加入相应体积的15mg/mL荧光素工作液
    腹腔注射（25-27gauge针头）	按10μL/g体重浓度，加入相应体积的15mg/mL荧光素工作液
    肌肉注射（27gauge针头）	50μL，浓度为1～2mg/mL荧光素工作液
    鼻内注射（pipette）	50μL，浓度为3mg/mL荧光素工作液

  • 注射入体内10～20min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。
    注：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。