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D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。其作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。目前市场上有三种产品形式，D-荧光素（游离酸），D-荧光素钠盐，以及D-荧光素钾盐。这三种产品主要的差别在于溶解特性上。D-荧光素（游离酸）水溶性以及缓冲体系的溶解性都很弱，除非溶于弱碱如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10mg/mL）和DMSO（50mg/mL）。但钠盐和钾盐形式的D-荧光素能够非常容易且快速的溶入水或者缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成液体后的这三种产品，在绝大多数的应用上都没有实质性的差别。

• 本品（firefly luciferin）和甲虫荧光素（beetle luciferin）仅仅是不同公司在命名上的差异，都是指化合物(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylic acid。
  
• 注射方式、动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳的检测时间。
  
• 如果要进行ATP的检测，尽量避免外源ATP的污染，如操作时戴手套并使用ATP-free的实验耗材，在进行荧光素的溶解时应使用ATP-free无菌水。
  
• 本品要进行避光操作和保存。储存液过滤除菌后可分装于-20℃或-80℃冻存。如果有条件，可对储存液充入氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间长达1年。
  
• 在进行D-荧光素钾盐的溶解时，应使用无钙镁离子的DPBS，因钙镁离子可能会抑制荧光素酶的活性，此外镁离子可能会对荧光素的氧化造成影响，从而影响检测。

• 体外生物发光检测
  
  • 用无菌蒸馏水溶解D-荧光素钾盐，配制成30mg/mL的储存液(100～200×)，混匀。立即使用，或分装于-20℃避光保存，避免反复冻融。
    
  • 用预热好的组织培养基将储存液稀释至0.15～0.3mg/mL的工作液浓度。
    
  • 去除细胞培养基。
    
  • 待图像分析前，向细胞内添加荧光素工作液，37℃孵育5～10min，然后进行图像分析。
• 活体成像分析
  
  • 用无菌的DPBS (w/o Mg²⁺、Ca²⁺)配制15mg/mL的荧光素的储存液，混匀。
    
  • 用0.2μm滤膜过滤除菌。立即使用，或分装于-20℃避光保存，避免反复冻融。
    
  • 腹腔注射（i.p.），按照150mg/kg的荧光素/体重浓度进行注射。
    
  • 注射入体内10～15min（待光信号达到最强稳定平台期）后进行成像分析。
    注：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。