石蜡包埋组织RNA提取试剂盒

产品货号：

YTB5633

中文名称：

石蜡包埋组织RNA提取试剂盒

英文名称：

RNasy Paraffin-embedded Tissue RNA Purification Spin Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本制品是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后提取切片样品中RNA的试剂盒。提取获得的RNA长度通常大于200个核苷酸，可以应用于反转录、RT-PCR、qRT-PCR或转录组测序等下游实验。本试剂盒也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA提取。

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构，以便于运输和储存，是病理样品长期保存的主要方法之一。组织样品经福尔马林固定时，组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联，核酸出现片段化，因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡，以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的RNA分子，最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中RNA与其它分子交联的不利影响，经本试剂盒提取获得的RNA纯度高、完整性好、质量稳定。

本试剂盒提取获得的石蜡包埋组织样品RNA纯度高。提取获得的RNA A260/A280的范围通常在1.8～1.9之间。
本试剂盒使用安全、高效。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行RNA分离纯化，能有效避免常规方法提取RNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。
本试剂盒操作快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，纯化RNA操作过程仅需约15分钟即可完成。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。百奥莱博同时提供更加便捷的磁珠法石蜡包埋组织RNA提取试剂盒，且磁珠法提取得到的RNA包含<200nt的小RNA或部分降解、断裂RNA，提取更完全。

组分	规格
脱蜡剂	50mL
裂解液	10mL
结合液	15mL
洗涤液I	51mL
洗涤液II	16mL
洗脱液	12mL
蛋白酶K	0.6mL
RNA纯化柱及废液收集管	50套
RNA洗脱管	50个

保存：室温，有效期1年。

注意事项

本试剂盒的标准操作步骤提取得到的RNA含有少量DNA，但如果按照可选步骤加入DNase I，就可以获得不含DNA的高纯度RNA。
蛋白酶K室温(15～25℃)存放一周，活力无明显下降。
如果希望获得更高质量的RNA，宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4～10%福尔马林中固定，固定时间最好在8～24小时之间或更短时间，长时间固定会使RNA断裂更为严重。
样品包埋前应确保彻底脱水，残留的甲醛可能抑制蛋白酶K的消化等相关实验步骤。
本试剂盒提取RNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长(＞1年)易破坏RNA完整性，无法提取出长片段。
石蜡包埋组织提取得到的RNA，由于样品的特殊性，存在可能的断裂或降解，通常不建议用于需要全长RNA的下游应用。
如需制备不含DNA的高纯度RNA，需自备DNase I，推荐使用DNase I溶液。
温度较低时裂解液或结合液中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍，如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
第一次使用前小包装洗涤液I需添加9mL无水乙醇，洗涤液II需添加48mL无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
本试剂盒须将FFPE样品56℃和80℃孵育。
使用本试剂盒须提前备好无水乙醇和异丙醇。
除特别说明外，每次Vortex应控制在5～10秒左右。
本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
废液收集管在一次提取中需多次使用，切勿中途丢弃。
脱蜡剂和蛋白酶K对人体有呼吸道、生殖等特定器官毒性，或致畸致癌毒性，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
洗涤液I对人体有害或有刺激性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

样品处理：
- 石蜡包埋组织切片：取2～8张的石蜡切片(5～10μm厚，表面积小于1×1cm2)。
  - 如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。
- 福尔马林固定组织：取10～25mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5mL离心管中，加入500μL的PBS(pH7.4，无酶无菌)，Vortex震荡混匀，12000×g离心1分钟后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2h开始操作。
脱蜡和裂解：
- 将石蜡切片置于1.5mL离心管中，加入600μL的脱蜡剂，剧烈Vortex 30秒，以充分脱蜡。
  - 福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂，直接转入步骤2h开始操作；如果石蜡样品过多，可以将脱蜡剂用量增加至1mL。
- 室温，≥14000×g离心5分钟。
- 使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
- 加入1mL无水乙醇，Vortex混匀。
- 室温，≥14000×g离心5分钟。
- 使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
  - 可以用新的10μL吸头小心吸去残留的乙醇，有利于乙醇挥发。
- 打开管盖，室温放置5～10分钟直至残留的乙醇完全挥发。
  - 残留的乙醇会对RNA产生影响，可以将离心管置于37℃环境下挥发乙醇。
- 加入150μL裂解液和10μL蛋白酶K，Vortex混匀，56℃金属浴或水浴孵育15分钟或直至样品完全裂解。
- 将完全裂解的组织样本置于80℃孵育15分钟，之后短暂离心使管盖上的蒸发液体回到管中。
  - 80℃孵育对修复RNA变性解交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的RNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至80℃再放入样本进行孵育。
- 室温，14000×g离心5分钟，转移上清液(约150μL)至新的离心管中，注意不要碰到沉淀。
- 向上述新的离心管中加入290μL结合液，Vortex混匀；再加入670μL异丙醇，Vortex混匀。
  - 加入结合液和异丙醇后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀彻底混匀，但不会干扰后续实验。
纯化RNA：
- 将600μL步骤2k中的混合溶液加入到RNA纯化柱内。≥6000×g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 将剩余的步骤2k中的混合溶液加入到RNA纯化柱内。≥6000×g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 向纯化柱中加入500μL洗涤液I，≥6000×g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 清除DNA(可选做)。如果希望获得不含DNA的高纯度RNA，可向RNA纯化柱中央加入80μL含有10U DNase I的酶溶液，室温放置消化15分钟。
  - 推荐使用DNase I溶液，每80μL酶溶液按照71.8μL超纯水加8μL 10×Reaction Buffer再加0.2μL 50U/μL DNase I混合配制而成。消化结束后，不需要进行离心等任何额外的操作，直接进入步骤3e。
- 向纯化柱中加入500μL洗涤液I，≥6000×g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 向纯化柱中加入600μL洗涤液II，≥14000×g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 重复步骤3f一次。
- 再≥14000×g离心1分钟，以去除残留的乙醇。
  不可把步骤3g的离心时间延长而省略本步骤，倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
- 将RNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入30～100μL洗脱液。室温放置1～3分钟。≥14000×g离心1分钟。所得液体即为纯化得到的RNA。
  - 洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水。使用较小体积的洗脱液可以使获得的RNA的浓度较高，但洗脱下来的RNA量相对较少。洗脱液的pH对洗脱效率有很大影响，使用去离子水洗脱时应保证其pH值在7.0～8.5之间。如果对于获得较多量的RNA非常重要，可以在第一次洗脱后，再用同体积洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可增加RNA洗脱量，但会降低洗脱RNA的浓度。经65℃预热过的洗脱液可增加RNA的洗脱量。

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