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本制品是一种使用新型核酸纯化介质包被的磁珠，可以从动物组织或培养的动物细胞中安全、便捷、稳定、高效、高质量地抽提总RNA的试剂盒。抽提获得的RNA包含大分子量RNA和小RNA(<200nt)，也常被称为总RNA(Total RNA)，可以用于各种常规分子生物学和生化检测等用途。

本试剂盒适用于新鲜或冻存的动物组织或细胞RNA的抽提，推荐的细胞用量为50～100万(上限可达500万)，组织用量为15～20mg (上限可达30mg)。不同的组织或细胞用量上限会有所差别，例如小鼠肝脏组织的上限可达30mg，但肌肉组织的上限约为20mg。

本试剂盒抽提得到的RNA可用于反转录、RT-PCR、qPCR、Northern、点杂交(Dot Blot)、纯化mRNA、体外翻译、RNase protection assay、cDNA克隆等下游实验；也可用于基因表达芯片分析(microarray)、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。

动物组织或细胞中的RNA按照长度可以分为长链RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，长链RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。长链RNA按照是否编码蛋白或多肽可以分为长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非编码的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。

• 本试剂盒使用安全。本试剂盒通过特殊的磁珠纯化介质进行RNA分离纯化，能有效避免传统的Trizol法抽提时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。
  
• 本试剂盒使用便捷。本试剂盒采用磁珠纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，抽提操作过程仅15～20分钟。相比于传统的Trizol抽提法，本试剂盒的操作流程显著简化，缩短了抽提时间，降低了RNA被降解的风险。和国外同类磁珠纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。
  
• 本试剂盒抽提RNA的得率高。本试剂盒的抽提效果经反复测试，100万个HeLa细胞能抽提得到约15～20μg RNA，20mg小鼠肝组织能抽提得到约25～35μg RNA，20mg小鼠脑组织能抽提得到约10～20μg RNA(新鲜样品的得率高于冻存样品)。

组分	10T	50T	200T	保存
BalbMag RNA磁珠	0.2mL	1mL	4mL	4℃
裂解液	6mL	30mL	120mL	室温
结合液	4.8mL	24mL	100mL
洗涤液I	6.5mL	32mL	125mL
洗涤液II	13mL	63mL	125mL×2
洗脱液	1mL	5mL	20mL
DNase	20μL	100μL	400μL	-20℃
10×Reaction Buffer	100μL	500μL	2mL

保存：按标签指示条件保存，有效期1年。

• 三个规格试剂盒（10T、50T、200T）中的结合液，第一次使用前分别加入加1.2、6mL、24mL的无水乙醇
  
• 对于富含RNase的样品(如动物组织)，建议使用前在裂解液中添加二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)至终浓度为40mM (例如1mL裂解液中加入20μL 2M DTT)或β-巯基乙醇至终浓度为1% (如1mL裂解液中加入10μL β-巯基乙醇)。含DTT或β-巯基乙醇的裂解液可在室温放置1个月。
  
• 如果不使用试剂盒提供的DNase I进行处理，本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量的DNA。后续如进行某些对DNA残留较敏感的实验时，需要在使用说明中步骤4后，在磁珠中加入适量DNase I进行消化，具体请参考使用说明。
  
• 建议使用推荐的细胞数或组织量用于RNA的抽提，否则可能导致BalbMag RNA磁珠聚集而使基因组DNA消化不充分。如果基因组DNA消化不充分，可以加大DNase I的用量或延长孵育时间。DNase I如果需要加大，可以考虑订购DNase I溶液。
  
• 本试剂盒提供的所有试剂都是RNase-free，操作时应小心，避免被RNase污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
  
• 对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 使用冻存的细胞或组织抽提RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织略差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并导致样品中的RNA少量或部分降解。对于组织样品，推荐使用动物组织RNA保存液进行保存以保证样品RNA的完整性。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。
  
• 结合液、洗涤液中含有一定浓度的乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。

本试剂盒抽提RNA的基本流程如图1所示。样品在裂解液中迅速裂解，释放出总RNA，然后让RNA特异性地结合到磁珠上，再通过3次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质，最后用洗脱液将高纯度的RNA洗脱下来。

图1.BalbMag磁珠法动物RNA提取试剂盒提取RNA原理的示意图。


本试剂盒与柱式动物RNA提取试剂盒的方法及T公司同类产品的抽提效果对比参见图2。由图2可见，本试剂盒在抽提细胞样品的RNA时，抽提得到的RNA的量与百奥莱博的柱式试剂盒和T公司同类产品相当。

图2.BalbMag磁珠法动物RNA提取试剂盒(货号：YTB4635)与RNasy柱式动物RNA提取试剂盒(货号：YTB4004)、T公司同类产品的RNA抽提效果对比。样品为新鲜培养的50万个HEK 293T细胞。洗脱液用量均为50μL。均取8μL洗脱的样品经混合2μL 6×DNA上样缓冲液，在1.2%琼脂糖凝胶中电泳约30分钟后拍照。实际抽提效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，本图仅供参考。

• 样品的准备。
  
  • 细胞样品：收集50～100万左右的细胞。对于悬浮细胞，1000～2000×g离心1分钟后弃上清，加入300μL裂解液，轻轻吹打8～10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300μL裂解液，轻轻吹打5～10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。
    
  • 组织样品：取15～20mg动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μL裂解液。也可将组织置于1.5mL离心管中，迅速加入600μL冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8～10次，室温放置3～5分钟。然后约14000×g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
  • 细胞的数量一般不超过200万，最多不超过500万，不超过100万细胞宜使用300μL裂解液，多于100万细胞宜使用600μL裂解液。动物组织的用量一般不超过30mg，用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后，离心管下部可能会有一些胶状物质，宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物，会导致得率下降约30～50%。后续加入结合液后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品，裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
• 加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3～5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。
  
• 将混合物(包括沉淀物)转移至新的1.5mL离心管内，加入20μL BalbMag RNA磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置3～5分钟。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
  • 磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
• 加入600μL洗涤液I，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
  
• 选做：如果略去本步骤，通过本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量基因组DNA。后续如进行某些对基因组DNA残留较敏感的实验时，可在上一步骤洗涤后，在磁珠中加入80μL含2μL DNase的酶溶液(每80μL酶溶液按照71.8μL水加8μL 10×Reaction Buffer再加2μL DNase混合配制而成)，37℃放置消化15～30分钟。消化结束后，不需要进行任何额外的操作，直接进入步骤6。
  
• 加入600μL洗涤液II，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
  
• 重复步骤6一次。
  
• 将离心管室温放置5～10分钟，或置于37℃鼓风烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
  
• 加入50～100μL洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3～5分钟，其间甩动离心管1～2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20℃保存。所得溶液即为纯化的RNA。
  • 如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15～40%的RNA。

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