产品货号：
WH0058
中文名称：
石蜡包埋组织总RNA提取试剂盒
英文名称：
Total RNA Extraction Kit from Paraffin Embedded Tissues
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒可从福尔马林固定石蜡包埋组织切片（以下简称FFPE)中提取总RNA。由于固定和包埋的条件限制，FFPE样本核酸通常发生片段化并且会被甲醛化学修饰，因此较难提取，本试剂盒提取的RNA可应用于RT-PCR等下游试验。
产品应用：
·采用硅基质膜柱法纯化方式，在可能的程度内获得的总RNA纯度更高、信息更为完整。
·相对于传统方法，操作更为简便、快捷。
·适用于下游的RT-PCR或RT-qPCR等实验检测。
提取实例：
上图为本试剂盒提取大鼠肝脏石蜡包埋切片样本总RNA，用50μl RNase-free ddH2O洗脱后，取8μl上样，1%琼脂糖凝胶，6V/cm电泳20min。起始量：约15mg组织。
试剂盒组成：
储存条件：室温（15-25℃)保存。DNase I，缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O（管装)置于2-8℃保存。
自备试剂：二甲苯、无水乙醇
使用前注意事项：
1．第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
2．DNase I储存液的配制：将DNase I干粉（1500U）溶解在550μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。
起始材料：
1．标准的福尔马林固定石蜡包埋程序也常常会造成核酸的片段化。为了尽量降低RNA片段化的可能性,应该按照以下操作步骤进行样本处理：
·组织切除后应尽快浸入4%-10%的福尔马林溶液中；
·固定时间最好为14-24h（固定时间过长会导致RNA片段化更严重,不利于下游的试验；
·样本包被之前必须彻底脱水。
2．应采用新鲜的FFPE组织切片,切片厚度不超过10μm，切片过厚可能会造成RNA得率低，每次制备采用的切片数应不超过8片，表面积应不超过250mm2。
3．如果没有起始样本的信息，建议初次制备采用的切片数应不超过2片，然后根据RNA的得率和纯度，下次制备采用的切片数可以进行调整，但应不超过8片。
操作步骤：
1．将石蜡样品切成5-10μm厚的片状。
注意：如果样品表面暴露于空气中,最初的2~3片弃掉不用。
2．迅速将2-8张切片置于1.5ml RNase-Free的离心管中，加入1 ml二甲苯，剧烈涡旋10 sec。
3．室温（15-25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min。
4．用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀。
5．加入1 ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。
6．室温（15-25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min。
7．用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀（用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇）。
8．打开管盖，室温（15-25℃)或37℃放置10 min直至残余的乙醇挥发完全。
注意：完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。
9．加入200 μl裂解液RF以及10 μl Proteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀。
10．55℃孵育15 min之后80℃孵育15 min。
11．室温（15-25℃)，12000rpm（~13400×g)离心5 min，转移上清入新的RNase-Free离心管中。
12．加入220 μl的缓冲液RB，涡旋混匀。
13．加入660 μl的无水乙醇，涡旋混匀（可能会出现沉淀)。
14．转移700 μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm（~13400×g)离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
15．重复步骤14，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
16．DNase I工作液的配制：取10 μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
17．向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
18．向吸附柱CR3中加入500 μl去蛋白液RW1，室温（15-25℃)，12000rpm （~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
19．向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
20．重复步骤19。
21．室温（15-25℃)，12000rpm（~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
22．将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm（~13400×g)离心2min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。配置胶用RNA专用系统。
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产品应用：
·采用硅基质膜柱法纯化方式，在可能的程度内获得的总RNA纯度更高、信息更为完整。
·相对于传统方法，操作更为简便、快捷。
·适用于下游的RT-PCR或RT-qPCR等实验检测。
提取实例：
上图为本试剂盒提取大鼠肝脏石蜡包埋切片样本总RNA，用50μl RNase-free ddH2O洗脱后，取8μl上样，1%琼脂糖凝胶，6V/cm电泳20min。起始量：约15mg组织。
试剂盒组成：
| 组分 | 50T |
| 裂解液RF | 12ml |
| 缓冲液RB | 12ml |
| 去蛋白液RW1 | 40ml |
| 漂洗液RW | 12ml |
| Proteinase K | 500μl |
| RNase-Free ddH2O（瓶装） | 40ml |
| RNase-Free吸附柱CR3（含2ml收集管） | 50套 |
| DNase I | 1500U |
| 缓冲液RDD | 4ml |
| RNase-Free ddH2O（管装） | 1ml |
| RNase-Free离心管（1.5ml） | 50个 |
储存条件：室温（15-25℃)保存。DNase I，缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O（管装)置于2-8℃保存。
自备试剂：二甲苯、无水乙醇
使用前注意事项：
1．第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
2．DNase I储存液的配制：将DNase I干粉（1500U）溶解在550μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。
起始材料：
1．标准的福尔马林固定石蜡包埋程序也常常会造成核酸的片段化。为了尽量降低RNA片段化的可能性,应该按照以下操作步骤进行样本处理：
·组织切除后应尽快浸入4%-10%的福尔马林溶液中；
·固定时间最好为14-24h（固定时间过长会导致RNA片段化更严重,不利于下游的试验；
·样本包被之前必须彻底脱水。
2．应采用新鲜的FFPE组织切片,切片厚度不超过10μm，切片过厚可能会造成RNA得率低，每次制备采用的切片数应不超过8片，表面积应不超过250mm2。
3．如果没有起始样本的信息，建议初次制备采用的切片数应不超过2片，然后根据RNA的得率和纯度，下次制备采用的切片数可以进行调整，但应不超过8片。
操作步骤：
1．将石蜡样品切成5-10μm厚的片状。
注意：如果样品表面暴露于空气中,最初的2~3片弃掉不用。
2．迅速将2-8张切片置于1.5ml RNase-Free的离心管中，加入1 ml二甲苯，剧烈涡旋10 sec。
3．室温（15-25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min。
4．用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀。
5．加入1 ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。
6．室温（15-25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min。
7．用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀（用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇）。
8．打开管盖，室温（15-25℃)或37℃放置10 min直至残余的乙醇挥发完全。
注意：完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。
9．加入200 μl裂解液RF以及10 μl Proteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀。
10．55℃孵育15 min之后80℃孵育15 min。
11．室温（15-25℃)，12000rpm（~13400×g)离心5 min，转移上清入新的RNase-Free离心管中。
12．加入220 μl的缓冲液RB，涡旋混匀。
13．加入660 μl的无水乙醇，涡旋混匀（可能会出现沉淀)。
14．转移700 μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm（~13400×g)离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
15．重复步骤14，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
16．DNase I工作液的配制：取10 μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
17．向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
18．向吸附柱CR3中加入500 μl去蛋白液RW1，室温（15-25℃)，12000rpm （~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
19．向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
20．重复步骤19。
21．室温（15-25℃)，12000rpm（~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
22．将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm（~13400×g)离心2min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。配置胶用RNA专用系统。
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