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本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总RNA。适合从小于30mg的石蜡包埋组织或切片中抽提高纯度的总RNA，本试剂盒无需使用酚/氯仿抽提和异丙醇沉淀，一小时内即可完成多个样品的抽提。本制品使用专门优化的裂解液和蛋白酶K，释放福尔马林固定或组织切片样本中的RNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效释放组织切片中的RNA，而避免危害RNA的完整性；优化的缓冲系统使裂解液中的RNA可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；可通过漂洗步骤有效去除，经过洗脱的RNA可直接用于RT-PCR、Real-Time PCR和印迹分析等实验。

• 向蛋白酶K中加入0.625mL蛋白酶K保存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K溶液勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
    
  • 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
    
  • 配制溶液应使用RNase-Free Water。
    
  • 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
• 获得样品后，要尽快将样品在4%～10%的福尔马林中固定，固定时间以14～24小时为宜，时间过长易导致RNA断裂，影响下游实验。
  
• 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制蛋白酶K的作用。
  
• 第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在缓冲液RW2中加入无水乙醇。
  
• 使用前请检查缓冲液GTL、缓冲液GL和缓冲液DS是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将缓冲液GTL、缓冲液GL和缓冲液DS于56℃水浴重新溶解。

• 样本处理
  
  • 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5～10μm的薄片。
    注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2～3片弃掉不用。
    
  • 福尔马林等固定液中的样本：取约20mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μL 10mM PBS（PH7.4），涡旋振荡，12000rpm（～13400×g）离心1分钟，弃上清，重复3次，可直接进行第3步操作。
• 选择方案A或方案B去除石蜡
  方案A
  
  • 取约1×1cm2的切片（共约4～5片切片）置于离心管(自备)中，加入500μL 缓冲液DS，涡旋震荡10秒。56℃孵育3分钟。
    
  • 12000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸到沉淀。
  方案B
  
  • 取约1×1cm2的切片(共约4～5片切片)置于离心管(自备)中，加入1mL二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
    
  • 12000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
    
  • 加入1mL无水乙醇，涡旋震荡混匀。12000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
    
  • 打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
• 加入150μL 缓冲液GTL，重悬沉淀；加入10μL 蛋白酶K溶液，涡旋震荡混匀。
  
• 56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
  注意：
  ① 此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成RNA断裂，产生RNA碎片。
  ② 56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到80℃后再把样品置于80℃孵育。
  
• 置于冰上3min，12000rpm离心15分钟，将上清转移至新的离心管中，小心不要吸到沉淀。
  
• 在上清中加入320μL 缓冲液GL，涡旋震荡彻底混匀。
  
• 加入720μL无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
  注意：加入无水乙醇后，可能有少量沉淀物析出，但不影响后续操作。
  
• 将步骤7中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（离心吸附柱RS）
  中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  可选步骤：若需去除基因组DNA，可按照以下步骤进行
  
  • 向吸附柱中加入350μL 缓冲液RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
    
  • 配制DNase I混合液：取52μL RNase-Free Water，向其中加入8μL 10×反应缓冲液和20μL DNase I（1U/μl），混匀，配制成终体积为80μL的反应液。
    
  • 向吸附柱中直接加入80μL DNase I混合液，20～30℃孵育15分钟。
    
  • 向吸附柱中加入350μL 缓冲液RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
• 向吸附柱中加入500μL 缓冲液RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 重复步骤9。
  
• 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
  注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
  
• 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20～50μL RNase-Free Water，室温放置2～5分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-20℃保存RNA。
  注意：
  ① RNase-Free Water体积不应小于20μL，体积过小影响回收率。
  ② 如果要提高RNA的产量，可用20～50μL新的RNase-Free Water重复步骤12。
  ③ 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。