产品目录

本制品是一种适用于各种动植物、细菌组织、细胞的总RNA抽提试剂，具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，并有效抑制样本中RNA的降解，保持RNA的完整性。样品在该试剂中能够充分裂解，之后加入氯仿离心分层，形成上清层、中间层和有机层(鲜红色下层)，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可得到总RNA。提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可直接用于Northern、点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR、poly(A)+选择、RNA酶保护分析以及构建cDNA文库等多种分子生物学实验。

此外，样品中的DNA和蛋白也能以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，而在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

本品操作简单快速，所有操作可在一小时内完成。对少量的组织(50～100mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>10⁷)均有较好的裂解效果。

• 本制品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会引起中毒、灼伤及其他身体伤害。使用时应穿戴防护物，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛时，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。
  
• 请穿实验服并佩戴一次性手套操作，避免RNase污染。
  
• 需自备氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇(DEPC处理水配制)、DEPC和DEPC处理水。
  
• 样品用Total RNA Extraction Reagent匀浆后，如果不加入氯仿进行下游实验，可先-70℃冻存，可保存一个月以上。
  
• RNA沉淀在75%乙醇中，4℃可保存1周，-20℃可保存1年。
  
• RNA半衰期比较短，易降解，建议抽提后尽快进行后续实验。

• 样品的处理
  
  • 样品匀浆
    
    • 贴壁细胞
      弃去培养液，直接往直径3.5cm的培养板中加入1mL Total RNA Extraction Reagent，覆盖并反复吹打裂解细胞。
      注：
      ① 依据培养板的面积而不是细胞的数量来决定Total RNA Extraction Reagent的所需量（每10cm2加1mL）。
      ② 加入Total RNA Extraction Reagent量不足时，会导致DNA污染。
      ③ 贴壁细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全。此时，细胞膜实际已完全裂开，并释放RNA，继续后续实验即可。
      
    • 悬浮细胞
      离心收集细胞沉淀，每5×10⁶～1×10⁷个细胞加入1mL Total RNA Extraction Reagent，用移液器反复吹打。
      注：加入Total RNA Extraction Reagent前应避免洗涤细胞，否则会增加mRNA降解的可能性。裂解某些酵母和细菌可能需要使用匀浆器。
      
    • 动、植物组织
      取-70℃冻存动物组织在液氮中充分研磨，按照表1加入适当量Total RNA Extraction Reagent混匀。或取新鲜动植物组织尽量剪碎，加入适当量Total RNA Extraction Reagent，匀浆仪进行匀浆处理。
      注：样品体积不要超过加入Total RNA Extraction Reagent体积的10%。
  • 将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。
    
  • (可选）4℃，12000g离心10min，取上清。
    注：离心可去除样品中较多蛋白质、脂肪、多糖或肌肉，植物的块茎结节等。离心后的沉淀中包含有细胞外膜、多糖以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂应尽量去除，取澄清的匀浆液进行后续实验。
• 总RNA提取
  
  • 向上述裂解液中加入1/5体积氯仿（如每1mL Total RNA Extraction Reagent加入0.2mL氯仿）。盖紧离心管盖，剧烈震荡15sec，室温静置2～3min。
    
  • 4℃，12000g离心10～15min。
    注：
    ① 离心后混合物可分3层：上层无色水样层，中间层，下层红色有机苯酚氯仿层。RNA存在于水样层中。
    ② 上层容量约为所加Total RNA Extraction Reagent总量的50～60%。如加入1mL Total RNA Extraction Reagent，上层水相约为500～600μL。建议吸取400～500μL，以防吸到中间层造成DNA污染。
    ③ 有机相和中间层是蛋白和DNA，可用于后续抽提。
    
  • 小心吸取上层水相至新离心管中，加入1/2体积异丙醇（如每1mL Total RNA Extraction Reagent加入0.5mL异丙醇）。颠倒混匀后室温放置10min。
    
  • 4℃，12000g离心10min。
    注：RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
    
  • 小心弃去上清，加入等体积75%乙醇（DEPC水配制，如每1mL Total RNA Extraction Reagent加入1mL 75%乙醇）。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。
    
  • 4℃，7500g离心5min，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。
    注：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸到沉淀。
    
  • 室温放置空气干燥5～10min。加入30～100μL无RNase水溶解RNA，待完全溶解后，取少量检测，其余溶液-70℃保存。
    注：RNA沉淀不能彻底干燥，过分干燥会导致RNA溶解度降低。
• 产物检测
  
  • RNA完整性检测
    
    • 取1μL RNA加入适当RNA loading buffer，混匀。
      
    • 进行电泳检测。若出现清晰的三条带，证明RNA完整性较好。
  • RNA纯度检测
    检测260nm，280nm OD值，并计算A260/A280比值。纯的RNA的比值应在2.0左右。